基于COI序列的紫河車藥材及其混偽品的DNA條形碼鑒定研究

陳俊+賈靜+徐曉蘭+辛天怡+張紅印+石林春+姚輝+劉冬+吳珍紅

[摘要]利用COI序列對紫河車及其常見混偽品進行DNA條形碼分子鑒定，探究準確、快速鑒定紫河車及其混偽品的方法。該研究共收集6個種41份樣品，以COI作為條形碼序列，對紫河車的正品及其混偽品提取基因組DNA，通過PCR擴增和雙向測序，運用CodonCode Aligner進行序列拼接后，采用 MEGA6.0 軟件進行序列比對，分析比較種內(nèi)、種間序列差異，并構(gòu)建正品紫河車及其混偽品的NJ樹。結(jié)果表明紫河車COI序列種內(nèi)平均K2P距離為0.001，種內(nèi)最大K2P距離為0.008，紫河車的正品來源人與其混偽品種間存在較多變異位點。由所構(gòu)建的NJ 樹顯示紫河車與其混偽品均可明顯區(qū)分?；贑OI序列的DNA條形碼技術(shù)可以鑒定紫河車及其混偽品，為紫河車的鑒別提供了新的工具。

[關(guān)鍵詞]紫河車；COI序列；DNA條形碼；鑒定

紫河車為健康人的干燥胎盤，將新鮮胎盤除去羊膜和臍帶，反復(fù)沖洗至去凈血液，蒸或置沸水中略煮后，干燥^[1]。最早載于《本草拾遺》，又名人胞衣、胎衣，《本草綱目》稱紫河車。中醫(yī)認為，紫河車性味甘、咸、溫，入肺、心、腎經(jīng)，有補腎益精、益氣養(yǎng)血之功效。由于紫河車來源緊缺，不易獲得，臨床需求量較大，藥材市場上充斥著較多混偽品，多數(shù)是用家豬Sus scrofa domesticus 、黃牛Bos taurus 、水牛Bubalus bubalis、山羊Capra hircus、綿羊Ovis aries的胎盤進行冒充^[2]，大大降低了藥材質(zhì)量及臨床用藥安全。目前，對于紫河車的真?zhèn)舞b別除了傳統(tǒng)的感官鑒別外，還包括硫酸鹽沉淀法、聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效毛細管電泳等鑒別方法 [3-5]。

DNA條形碼技術(shù)是近年來興起的一種物種鑒定分類方法^[6]。標準的DNA序列對每個物種來講都是獨一無二的，每個位點皆有4個堿基的選擇，因此，從理論上來講可以編碼地球上的所有物種^[7]。DNA條形碼技術(shù)根據(jù)反映生物個體、居群或物種基因組中具有差異特征的DNA片段來鑒定，不受環(huán)境變化影響及經(jīng)驗的限制^[8]，其高效性、易操作的明顯優(yōu)勢，尤其適用于來源生物體部分組織或器官的中藥材的真?zhèn)舞b定^[9]。2003年，Hebert等^[10]對動物界11個門13 320個物種進行研究，線粒體COI基因能夠?qū)游锝绲拇蠖鄶?shù)物種進行準確鑒定區(qū)分，之后在對魚類^[11]、鳥類^[12]等鑒別上都證實了COI序列可以作為動物界中的標準條形碼序列。陳士林等^[13]對動物藥材的DNA條形碼分子鑒定方法進行了詳細的闡述。

本研究旨在通過DNA條形碼技術(shù)考察利用COI序列鑒別紫河車及其混偽品的可行性。

1 材料

紫河車及其混偽品總計6個種，41份樣品，包括20份實驗樣品（藥材樣品8份，新鮮原材料樣品12份）和21條GenBank序列。紫河車及其混偽品信息詳見表1，2。

2 方法

2.1 DNA提取 藥材樣品用 75%乙醇擦拭表面后，取藥材約35 mg，用滅菌剪刀將其剪碎后用DNA提取研磨儀（Retsch MM400，Germany）研磨2 min（30次/s），利用血液/細胞、組織基因組提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA。對于新鮮原材料樣品需在稱量后加入細胞裂解液方可用DNA提取研磨儀研磨。

2.2 PCR擴增及測序 PCR擴增引物：正向LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向HCO2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′^[14]。PCR反應(yīng)體積為25 μL，體系內(nèi)包含 ddH2O 8.5 μL，2.5 μmol·L-1引物各1.0 μL[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，模板DNA約2 μL。擴增程序：94 ℃，1 min；94 ℃，1 min，45 ℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5 個循環(huán)；94 ℃，1 min，50 ℃，1.5 min，72 ℃，1 min，35 個循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI3730XL測序儀進行雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)處理 測序峰圖利用CodonCode Aligner V4.2.7 （CodonCode Co.，USA）進行拼接校對，去除引物區(qū)，獲得樣品序列，從GenBank上獲得的COI序列使用CodonCode Aligner V4.2.7軟件，將其與拼接好的樣品序列進行比對后，去除與樣品序列相對應(yīng)之外區(qū)段，保留序列長度≥500 bp的序列。最后，將所有序列用軟件MEGA6.0 （molecular evolutionary genetics analysis）比對，進行遺傳距離等分析，并構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)聚類樹，利用bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗各分支的支持率。

3 結(jié)果

3.1 紫河車樣品DNA提取與PCR擴增 對紫河車及其混偽品新鮮原材料樣品的COI序列分析發(fā)現(xiàn)，所有樣品均可以進行PCR擴增并成功測序，瓊脂糖凝膠電泳得到PCR擴增電泳圖均可顯示出較亮條帶，擴增效果良好。但對于紫河車藥材樣品的PCR產(chǎn)物電泳，則有2個樣品并未顯示條帶。

3.2 紫河車藥材種內(nèi)及種間變異分析 紫河車種內(nèi)不同來源樣品15條COI序列片段長度658 bp，分為4個單倍型：單倍型A1序列全部與YC2017MT04相同，單倍型A2序列全部與YC2017MT14相同，單倍型A3序列全部與YC2017MT02相同，單倍型A4序列全部與YC2017MT05相同，共有變異位點數(shù)6個，見表3，其余位點堿基無差異?；贙2P模型計算遺傳距離，其COI序列種內(nèi)平均K2P距離0.001，種內(nèi)最大K2P距離0.008。endprint

由于紫河車藥材混偽品的基原動物豬、牛、羊與人的親緣關(guān)系相差甚遠，所以在此不對其進行種間變異分析。

3.3 紫河車藥材及其混偽品NJ系統(tǒng)聚類樹鑒別 基于COI序列構(gòu)建紫河車及其混偽品的NJ樹見圖1，紫河車藥材基原樣品單獨聚為一支，有明顯的單系性。混偽品家豬、黃牛、水牛、綿羊、山羊的COI序列也分別單獨聚為一支，支持率都達到了100%。因此，基于COI序列構(gòu)建的NJ樹能夠明顯區(qū)分紫河車藥材與其混偽品。

4 討論

4.1 紫河車藥材DNA提取注意事項與質(zhì)量分析 紫河車藥材經(jīng)過一定的炮制加工，在取樣時需注意取樣部位，觀察藥材整體，從藥材內(nèi)部取樣，避開藥材炮制表面，防止被其他污染物干擾實驗結(jié)果。本研究的DNA提取是按照試劑盒操作說明進行實驗，但通過多次反復(fù)實驗對比發(fā)現(xiàn)，對試劑盒操作步驟上進行部分優(yōu)化更容易獲得高質(zhì)量DNA。具體優(yōu)化操作如下：①對試劑使用量可酌情加倍，效果更好；②水浴時間可適當延長，使DNA充分溶出，提高樣品消化程度，實驗表明56 ℃水浴2 h效果較好。

對市售紫河車藥材進行DNA提取和PCR擴增時，有2個藥材樣品PCR產(chǎn)物顯示無條帶。分析影響紫河車藥材DNA提取質(zhì)量的因素有以下幾點：①紫河車藥材加工炮制過程對其DNA質(zhì)量有一定影響，導(dǎo)致DNA部分降解；②有研究報道發(fā)現(xiàn)，目前藥材市場上，除了使用豬、牛、羊胎盤作為混偽品摻假以外，還有不法商販摻入玉米粉、石膏、蒲黃等雜質(zhì)以增加其質(zhì)量或直接使用這些雜質(zhì)偽造紫河車藥材^[15]。這些摻假方式對紫河車藥材的DNA提取會產(chǎn)生較大影響。因此，在對紫河車藥材樣品取樣時應(yīng)避開藥材表面，取藥材內(nèi)部，盡量減少其他污染物對實驗的干擾。對于使用雜質(zhì)完全偽造而成的紫河車藥材，則需通過其他方法對其進行分析鑒定。

4.2 寄生蟲污染對紫河車藥材DNA條形碼鑒定的影響 紫河車藥材屬于動物藥材，藥材表面常存在寄生蟲，導(dǎo)致藥材被污染，且寄生蟲體內(nèi)含有COI基因片段，所以在PCR擴增時會出現(xiàn)將寄生蟲的COI序列擴增出來的可能性，進而影響實驗結(jié)果，降低COI條形碼序列鑒定的準確性及穩(wěn)定性。在本研究中，出現(xiàn)PCR擴增出馬六甲肉食螨Cheyletus malaccensis寄生蟲的情況。因此在取樣時可采取用滅菌刀片刮去外皮，避免寄生蟲COI序列的影響。

4.3 DNA條形碼對中藥材的實際鑒定意義 紫河車是我國常用傳統(tǒng)中藥材，市場及臨床需求量較大，但其來源緊缺，獲得途徑較少，藥材產(chǎn)量不高，進而導(dǎo)致藥材市場上混偽品較多，并且對其鑒別多數(shù)是基于傳統(tǒng)的性狀鑒定、顯微鑒定等鑒定方法。本研究證實了運用DNA條形碼鑒定紫河車及其混偽品的可行性，為紫河車藥材鑒定提供了新的方法。目前，DNA條形碼已運用到多種中藥材的鑒定上^[16-18]。

隨著中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展，大量品質(zhì)佳、療效好的中藥材逐漸被研究者制成湯劑、膏劑、丸劑、注射劑、片劑等劑型。中藥制劑的多種劑型，使傳統(tǒng)的鑒別方法對此有一定的局限性。張蓉等^[19]利用COI基因作為條形碼分析19種鹿茸飲片，在屬和種水平上將鹿科3屬9種鹿成功鑒別。羅焜等^[20]基于ITS2序列成功鑒定了86種秦艽藥材及其混偽品，并且從藥店購買的秦艽飲片中鑒定到基原物種。由此可見，DNA條形碼技術(shù)能夠快速、準確的對中藥材進行鑒定，并且不受藥材形態(tài)限制，直接在分子水平上鑒別，將正品與混偽品藥材區(qū)分開，是一種新興的生物鑒別方法，具有廣闊的發(fā)展?jié)摿ΑNA條形碼技術(shù)能為中藥材市場起到監(jiān)管作用，保證中藥材的質(zhì)量品質(zhì)，該技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)藥的融合，將對我國中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展起到推進作用。

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Identification of Placenta hominis and its adulterants using COI barcode

CHEN Jun1，JIA Jing2，XU Xiao-lan1，XIN Tian-yi3，ZHANG Hong-yin2，

SHI Lin-chun3，YAO Hui3，LIU Dong2，WU Zhen-hong1*

（1.Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China；

2.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；

3. Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，

Peking Union Medical College，Beijing 100193，China）

[Abstract] In order to provide a new method for the identification of Placenta hominis，the COI barcode has been employed to identify the P. hominis medicinal materials and its adulterants. Genomic DNA was extracted from the experimental samples. The COI sequences were amplified and sequenced bi-directionally. Sequence assembly and consensus sequence generation were performed using the CodonCode Aligner. NJ tree was constructed by MEGA6.0 software. COIsequences can be successfully obtained from all experimental samples. The intra-specific variation and inter-specific divergence were calculated. The average intra-specific K2P distance of P. hominis was 0.001 and the maximum intra-specific distance was 0.008. The cluster dendrogram constructed can be seen that the same genus is together，and distinguished from its adulterants. It is concluded that P. hominis and its adulterants can be correctly identified by DNA barcoding method.

[Key words] Placenta hominis； COI；DNA barcoding；identification

doi：10.4268/cjcmm20141211endprint