基于ITS2條形碼鑒定柴胡與大葉柴胡

于俊林+趙莎+任明波+錢齊妮+龐曉慧

[摘要]為準(zhǔn)確鑒定柴胡與大葉柴胡，該研究共48份柴胡、大葉柴胡藥材，擴(kuò)增ITS2 序列并進(jìn)行測序，采用CodonCode Aligner軟件進(jìn)行序列拼接，用軟件MEGA5.0分析比對確定不同的單倍型，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離等分析。采用相似性搜索法、最近距離法、構(gòu)建鄰接樹（NJ樹）法對柴胡與大葉柴胡進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示柴胡與大葉柴胡種間最小K2P距離為0.049，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于柴胡種內(nèi)最大K2P距離0.013。NJ樹顯示大葉柴胡獨(dú)自聚為一支，可明顯與柴胡區(qū)分。因此應(yīng)用ITS2條形碼可以準(zhǔn)確鑒定柴胡及大葉柴胡。

[關(guān)鍵詞]大葉柴胡；柴胡；ITS2；DNA條形碼

柴胡為常用中藥材，在我國臨床應(yīng)用已有2 000余年的歷史。2010年版《中國藥典》規(guī)定柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡B. scorzonerifolium Willd. 的干燥根^[1]。通過對全國27 個省、市、自治區(qū)的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有25 種、6 變種、1 變型在我國不同地區(qū)作為中藥柴胡入藥^[2]，導(dǎo)致柴胡藥材品種混亂，藥材質(zhì)量極不穩(wěn)定。《中國藥典》規(guī)定大葉柴胡B. longiradiatum Turcz.有毒，不可當(dāng)柴胡用。然而，有些地區(qū)仍將大葉柴胡做柴胡藥用，曾發(fā)生嚴(yán)重中毒事件^[3]。目前，大葉柴胡根莖的個子與片子行銷于藥材市場^[4]，雖然其個子易與北柴胡和南柴胡相區(qū)別，但其切制的片子不易區(qū)別，這就迫切要求對柴胡與大葉柴胡進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，以確保其臨床療效與安全。

DNA 條形碼是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對較短的DNA片段來進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)，是近年來生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)^[5]。Chen等^[6]通過對6 000 余份藥用植物樣本進(jìn)行DNA 條形碼序列篩選，發(fā)現(xiàn)ITS2序列的物種水平鑒定能力達(dá)到92.7%，首次提出以ITS2 為核心，psbA-trnH為補(bǔ)充序列的藥用植物條形碼鑒定體系。同時在薔薇科^[7]、蕓香科^[8]、石斛屬^[9]、重樓屬^[10]等藥用植物中得到驗證。繼而ITS2 序列作為DNA 條形碼的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性已在秦艽^[11]、羌活^[12]、人參^[13]、 枸杞^[14]、金銀花^[15]、山茱萸^[16]、卷柏科^[17]等中藥材中得到驗證。因此，國家藥典委員會討論通過在《中國藥典》增補(bǔ)本中列入中藥材 DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則，為中藥材準(zhǔn)確、可靠鑒定及臨床用藥安全提供新的技術(shù)手段^[18]。

目前，已有運(yùn)用性狀、顯微、薄層色譜、紅外、RAPD分析和ISSR分子標(biāo)記等方法對柴胡與大葉柴胡進(jìn)行鑒別的報道^[19-22]，其中Yang等^[23]應(yīng)用ITS序列對中國西北地區(qū)的包含11個種20份柴胡屬植物的樣本進(jìn)行鑒定，表明ITS 序列在柴胡藥材鑒定中具有一定實用性和可靠性。本研究基于ITS2 條形碼，對31份柴胡樣本及17份大葉柴胡樣本討論柴胡的種內(nèi)變異及柴胡與大葉柴胡的種間變異，以對兩者進(jìn)行鑒定，為保證臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料

本研究共48份樣品，分別為大葉柴胡根樣本13份，葉片樣本2份，復(fù)核樣本2份；柴胡藥材樣本16份，葉片樣本5份，復(fù)核樣本3份；從GenBank下載柴胡序列（已發(fā)表）7條（表1）。樣品經(jīng)通化師范學(xué)院制藥與食品科學(xué)學(xué)院于俊林教授鑒定，憑證樣本保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館。

2 方法

2.1 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增和測序 取研究材料根或原植物樣本20～40 mg，用DNA提取研磨儀30次/s研磨2 min后，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA 。PCR 反應(yīng)體積25 μL，PCR 反應(yīng)體系、ITS2 所用通用引物以及擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[6]。應(yīng)用ABI 3730XL 測序儀（Applied Biosystems Co. ，USA） 對純化后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。

2.2 數(shù)據(jù)處理 利用CodonCode Aligner V 3.7.1（CodonCode Co.，USA）對測序峰圖進(jìn)行校對拼接，去除引物及低質(zhì)量區(qū)，基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法去除兩端5.8S 和28S 區(qū)段。將所得序列用軟件MEGA5.0分析比對，確定不同的單倍型，基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離等分析。采用相似性搜索法（BLAST1）、最近距離法（nearest distance）、構(gòu)建鄰接樹（neighbor-joining tree，NJ Tree）對柴胡與大葉柴胡進(jìn)行鑒定。

3 結(jié)果

3.1 柴胡與大葉柴胡DNA 提取與ITS2 序列擴(kuò)增 柴胡與大葉柴胡藥材樣品提取到的基因組DNA 經(jīng)電泳后條帶大部分呈彌散狀態(tài)，少數(shù)不可見。PCR 產(chǎn)物電泳后均可顯示出條帶，說明藥材DNA 雖有降解，但仍可通過PCR 擴(kuò)增獲得其ITS2 序列。

3.2 柴胡及大葉柴胡ITS2 序列特征分析 本研究中17份大葉柴胡樣本ITS2 序列長度為233 bp；GC含量為59.7%，種內(nèi)無變異位點(diǎn)。31份柴胡樣本的ITS2 序列長度為233 bp；GC含量為58.4%，種內(nèi)存在4個變異位點(diǎn)，分為7個單倍型（表2）?；贙2P 模型計算遺傳距離，柴胡ITS2 序列種內(nèi)平均K2P 距離為0.004，種內(nèi)K2P遺傳距離為0～0.013；大葉柴胡種內(nèi)平均K2P距離為0；柴胡與大葉柴胡種間K2P遺傳距離為0.049～0.054，種間平均K2P距離為0.051。endprint

3.3 柴胡及大葉柴胡的鑒定 將獲得的序列在中藥材 DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)（http：//www.tcmbarcode.cn）應(yīng)用 BLAST1方法進(jìn)行結(jié)果判定，表明ITS2 序列可準(zhǔn)確鑒別柴胡與大葉柴胡。柴胡與大葉柴胡種間最小K2P距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于柴胡種內(nèi)最大K2P 距離，表明基于ITS2 序列應(yīng)用最近距離法可準(zhǔn)確鑒別柴胡與大葉柴胡。同時基于ITS2 序列構(gòu)建柴胡及大葉柴胡的 NJ 系統(tǒng)聚類樹（圖1），以柴胡屬近緣植物傘形科茴香屬植物茴香Foeniculum vulgare Mill.作為外類群（GenBank登錄號HQ377215，HQ377209），NJ樹顯示大葉柴胡獨(dú)自聚為一支，可明顯與柴胡區(qū)分，同樣表明ITS2 條形碼可準(zhǔn)確鑒別柴胡及大葉柴胡。

4 討論

4.1 柴胡與大葉柴胡DNA提取與PCR擴(kuò)增 柴胡及大葉柴胡樣本采用試劑盒一般都能成功提取其 DNA。本研究發(fā)現(xiàn)從藥材中提取的基因組DNA呈彌散狀態(tài)，少數(shù)不可見，但其PCR產(chǎn)物電泳后均可出現(xiàn)單一明亮條帶，經(jīng)純化后測序成功，表明ITS2條形碼序列較短，易擴(kuò)增，適合鑒定中藥材。

4.2 應(yīng)用ITS2條形碼鑒定柴胡與大葉柴胡的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性 復(fù)核樣本是指同一實驗樣本在不同實驗室、不同人員、不同儀器、不同工作日和實驗時間的條件下進(jìn)行實驗的樣本，實驗結(jié)果應(yīng)一致。在本研究中實驗和復(fù)核樣品的24個柴胡樣本及17個大葉柴胡樣本ITS2 序列均可穩(wěn)定獲得，說明采用ITS2條形碼鑒定柴胡藥材具有很好的穩(wěn)定性。在中藥材 DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)（http：//www.tcmbarcode.cn）應(yīng)用 BLAST1方法進(jìn)行結(jié)果判定，ITS2 序列可準(zhǔn)確鑒別柴胡與大葉柴胡，柴胡與大葉柴胡種間最小K2P距離遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于柴胡種內(nèi)最大K2P距離，同時NJ 樹顯示大葉柴胡獨(dú)自聚為一支，可明顯與柴胡區(qū)分，因此應(yīng)用ITS2條形碼可穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒定柴胡及大葉柴胡。

4.3 柴胡的種內(nèi)變異及柴胡與大葉柴胡的種間變異分析 31份柴胡樣本，ITS2序列種內(nèi)存在4個變異位點(diǎn)，分為7個單倍型，部分樣品序列在108位點(diǎn)處出現(xiàn)簡并堿基A/T，147位點(diǎn)處出現(xiàn)簡并堿基C/T，說明柴胡ITS2序列可能存在多拷貝現(xiàn)象，但其并未影響柴胡與大葉柴胡的鑒定，驗證了Song等報道的雖然ITS2在基因組存在多拷貝現(xiàn)象，但多數(shù)情況下主導(dǎo)變異類型已足夠進(jìn)行物種鑒定^[24]。大葉柴胡單倍型A1與柴胡單倍型B1在ITS2序列中存在11個變異位點(diǎn)，說明ITS2序列雖短，但在物種水平仍具有明顯的序列變異性，適合物種的鑒定。

部分中藥材品種混亂給中藥安全使用造成極大隱患，而傳統(tǒng)鑒定方法具有一定的局限性^[18]。柴胡藥材品種混亂，特別是市場中仍有大葉柴胡作為柴胡入藥，直接威脅到柴胡的安全用藥，需對市場中柴胡藥材做準(zhǔn)確鑒定，DNA 條形碼分子鑒定技術(shù)為中藥材基原物種的鑒定提供了強(qiáng)有力的科技支撐。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國藥典. 一部[S]. 2010： 263.

[2]Pan S L. Bupleurum species： scientific evaluation and clinical applications[M]. Boca Raton： Taylor & Francis Group，2006.

[3]趙吉福，郭允珍，孟憲紓. 大葉柴胡的毒性成分[J]. 藥學(xué)學(xué)報，1987，22（7）：507.

[4]李曉軍，郭月秋，石亞囡，等. 商品柴胡真?zhèn)舞b別[J]. 中藥材，2012，35（10）：1594.

[5]陳士林. 中藥DNA 條形碼分子鑒定[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2012：4.

[6]Chen S L，Yao H，Han J P，et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J]. PLoS ONE，2010，5（1）：e8613.

[7]Pang X H，Song J Y，Zhu Y J ，et al. Applying plant DNA barcodes for Rosaceae species identification[J]. Cladistics，2011，27（2）： 165.

[8]羅焜，陳士林，陳科力，等. 基于蕓香科的植物通用DNA條形碼研究[J]. 中國科學(xué)C輯：生命科學(xué)，2010，40（4）：342.

[9]Yao H，Song J Y，Ma X Y，et al. Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence： the chloroplast psbA-trnH intergenic region[J]. Planta Med，2009，75（6）： 667.

[10]朱英杰，陳士林，姚輝，等. 重樓屬藥用植物DNA 條形碼鑒定研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報，2010，45（3） ：376.

[11]羅焜，馬培，姚輝，等. 多基原藥材秦艽ITS2 條形碼鑒定研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報，2012，47（12）：1710.

[12]辛天怡，姚輝，羅焜，等. 羌活藥材ITS/ITS2 條形碼鑒定及其穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報，2012，47（8）：1098.

[13]Chen X C，Liao B S，Song J Y，et al. A fast SNP identification and analysis of intraspecific variation in the medicinal Panax species based on DNA barcoding[J]. Gene，2013，530（1）：39.endprint

[14]Xin T Y，Yao H，Gao H H，et al. Super food Lycium barbarum （Solanaceae） traceability via an internal transcribed spacer 2 barcode[J]. Food Res Int，2013，54（2）： 1699.

[15]Hou D Y，Song J Y，Shi L C，et al. Stability and accuracy assessment of identification of traditional Chinese materia medica using DNA barcoding： a case study on Flos Lonicerae Japonicae[J]. Biomed Res Int，2013，doi：org/10.1155/2013/549037.

[16]Hou D Y，Song J Y，Yao H，et al. Molecular identification of Corni Fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences[J]. Chin J Nat Med，2013，11（2）：121.

[17]Gu W，Song J Y，Cao Y，et al. Application of the ITS2 region for barcoding medicinal plants of Selaginellaceae in Pteridophyta[J]. PLoS ONE，2013，8（6）： e67818.

[18]陳士林，姚輝，韓建萍，等. 中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J]. 中國中藥雜志，2013，38（2）：141.

[19]童靜玲，胡敏. 柴胡與同屬幾種混偽品的生藥學(xué)鑒定[J]. 海峽藥學(xué)，2009，21（11）：104.

[20]劉和平，謝培山，田潤濤. 柴胡屬藥材皂苷高效薄層色譜指紋圖譜的研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2008，19（1）：38.

[21]劉軍，周群，孫素琴. 柴胡及其偽品大葉柴胡紅外光譜的分析與鑒定[C]. 北京：第十五屆全國分子光譜學(xué)術(shù)報告會，2008.

[22]梁之桃，秦民堅，王崢濤，等. 柴胡屬5種植物RAPD分析與分類鑒定[J].中草藥，2002，33（12）：64.

[23]Yang Z Y，Chao Z，Huo K K，et al. ITS sequence analysis used for molecular identification of the Bupleurum species from northwestern China [J]. Phytomedicine，2007，14（6）： 416.

[24]Song J Y，Shi L C，Li D Z，et al. Extensive pyrosequencing reveals frequent intra-genomic variations of internal transcribed spacer regions of nuclear ribosomal DNA[J]. PLoS ONE，2012，7（8）： e43971.

Identification of Bupleurum chinense and B. longiradiatum

based on ITS2 barcode

YU Jun-lin1，2，ZHAO Sha3，REN Ming-bo4，QIAN Qi-ni4，PANG Xiao-hui3*

（1.Jilin Key Laboratory of Changbai Mountain Medicinal Plants Research，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，China；

2.Department of Pharmacy and Food Engineering，Tonghua Normal University，Tonghua 134002，China；

3.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，

Beijing 100193，China；

4. Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation，Chongqing 408435，China）

[Abstract] In this study，ITS2 barcode was used to identify Bupleurum chinense and B. longiradiatum. The ITS2 regions of 48 samples were amplified and sequenced. The sequences obtained above were aligned and the K2P distances were calculated. We used three methods，BLAST1，nearest distance and phylogenetic tree （NJ-tree），to test the identification ability. The results showed that the maximum intraspecific genetic distance of B. chinense was 0.013，and the minimum interspecific genetic distance between B. chinense and B. longiradiatum was 0.049. The NJ-tree can easily identify B. chinense and B. longiradiatum. Therefore，the ITS2 barcode is suitable to identify B. chinense and B. longiradiatum.

[Key words] Bupleurum longiradiatum；B. chinense；ITS2；DNA barcoding

doi：10.4268/cjcmm20141202endprint