卡托普利對兔心房組織Cx40、Cx43表達增齡性變化的影響

陳春燕，韓新源，酉鵬華，程 功，孫超峰

(1. 西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內科，陜西西安 710061；2. 陜西省人民醫(yī)院心內科，陜西西安 710068)

心房顫動(atrial fibrillation, AF)的發(fā)病率呈現(xiàn)隨年齡的增長而增加的趨勢[1]。心房組織的結構和功能有明顯的增齡性衰退現(xiàn)象，表現(xiàn)為與衰老有關的心房纖維化、脂肪沉積等退行性改變，這些改變可以導致心房組織重構，從而為增齡相關性房顫的發(fā)生提供基質。縫隙連接(gap junction)是心肌細胞電信號快速傳導的低電阻通道，確保心肌電機械活動的同步。研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接蛋白(connexin，Cx)重構與房顫的發(fā)生和維持關系密切[2]，但其在心房組織中的表達是否存在增齡性改變目前尚不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)對房顫的發(fā)生和維持具有促進作用，阻斷RAS的藥物能夠抑制房顫時的心房重構[3]，但其是否能夠抑制增齡所致心房重構的研究報道甚少。本實驗通過觀察不同年齡段家兔心房組織細胞Cx表達的增齡性變化，探討衰老對心房肌Cx表達的影響，并研究卡托普利干預是否能夠逆轉這種增齡性變化，為增齡性房顫的防治提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物與材料健康家兔24只(由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)，雌雄不限。卡托普利(商品名：開博通，百時美施貴寶公司生產(chǎn))；血管緊張素ⅡELISA試劑盒(美國R&D公司)；Cx40多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；Cx43多克隆抗體(英國Abcam公司)；反轉錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司，TaKaRa Code：DRR037S)；實時定量聚合酶鏈反應試劑盒(寶生物工程大連有限公司，TaKaRa Code：DRR081A)。

1.2分組及給藥方法健康家兔分為3組：青年組(4～6月)、老年組(30～34月)、老年+卡托普利干預組，每組8只。老年干預組給予卡托普利5.5 mg/(kg·d)，用生理鹽水稀釋后灌胃給藥8周；非給藥老年組及青年組均以等容量的生理鹽水灌胃。

1.3體表心電圖的測定家兔麻醉后，固定在實驗臺上，連接好導線后，記錄體表Ⅱ導心電圖，采用分析軟件測量心率(HR)和P波時限，包括最大P波時限(Pmax)、最小P波時限(Pmin)，計算P波離散度(Pd)、P波平均時限(Pa)。

1.4心房組織AngⅡ含量的測定取出之前置于液氮中的組織，稱取約100 mg，將組織加入適量的生理鹽水搗碎。2 000 g離心10，取上清液。采用兔(Rabbit)ANG-ⅡELISA檢測試劑盒測定心房組織AngⅡ的含量，實驗按照說明書進行。

1.5Real-timePCR法檢測Cx40、Cx43的基因表達用Trizol提取心房組織總RNA，紫外分光光度法測定所抽提RNA的濃度以及A260/280值，A260/280值在1.8～2.0則視為純度很高，可以進行下一步操作。按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明進行反轉錄反應，反應條件為：37 ℃ 15 min(反轉錄反應)，85 ℃ 5 s(反轉錄酶的失活反應)合成cDNA。以NCBI GenBank提供的GAPDH、Cx40、Cx43的cDNA序列為模板，由北京三博遠志生物科技公司合成引物。引物序列如下：Cx40：上游：5′-ACGTCTGCAGCATTGTCATC-3′；下游：5′-CCCAGGTGGTAGAGTTCAGC-3′；Cx43：上游：5′-CTTGCTGCGAACCTACATCA-3′；下游：5′-AGAGGAAGCAGTCCACCTGA-3′；GAPDH：上游：5′-GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT-3′；下游：5′-TGCCGAAGTGGTCGTGGATGACCT-3′。按照TaKaRa Real-time PCR 試劑盒操作說明進行反應，采用三步法PCR擴增程序，第一步95 ℃ 3 min，第二步PCR反應95 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，第三步55 ℃ 10 s，81個循環(huán)。擴增曲線完成后自動生成融解曲線，反應完成后確認擴增曲線和融解曲線。根據(jù)Bio-Rad iQ5 Real-time PCR儀軟件得出的各個樣本的CT值，按照2-△△Ct法計算各個基因的相對表達量；用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，只有單一的擴增條帶，未見引物二聚體等非特異性條帶，說明擴增反應是特異的。

1.6Westernblot測定Cx40、Cx43的蛋白表達提取心房組織蛋白并定量分析，按每泳道加總蛋白20 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后用半干轉印法轉移至硝酸纖維素膜上，用TBST液封閉后加入1∶1 000稀釋的Cx40和1∶1 600稀釋的Cx43一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h，與顯色劑(A∶B=1∶1)于暗處反應5 min，后利用Chemidoc化學發(fā)光儀顯影成像，以BIO-RAD公司的Quantity One成像分析系統(tǒng)進行WB條帶的灰度值分析。以目的蛋白與內參蛋白β-actin比值作為目的蛋白的相對表達量。

2結果

2.1各組家兔體表心電圖測定結果的比較與青年組相比，老年組家兔心率明顯下降(P<0.01)，P波的Pmax、P min、Pd和Pa均顯著延長(P均<0.01)，而老年干預組與老年組相比心率增快，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，反應P波的各指標均有明顯的恢復(P均<0.05，表1)。

表1 各組家兔心電圖特征的比較

與青年組比較，*P<0.01；與老年組比較，#P<0.05。

2.2各組家兔心房組織AngⅡ含量的比較老年組心房組織AngⅡ濃度明顯高于青年組(P<0.05)。而老年卡托普利干預組心房組織AngⅡ質量濃度較老年組明顯降低(P<0.05，圖1)。

圖1 各組家兔心房組織AngⅡ含量的比較

2.3家兔心房組織Cx40、Cx43mRNA表達的比較實驗數(shù)據(jù)采用2-△△Ct的方法進行處理，家兔心房組織中Cx40和Cx43 mRNA的表達水平以Cx/GAPDH表示。與青年組比較，老年組Cx40及Cx43 mRNA水平明顯降低(P<0.01)；而卡托普利干預后心房組織Cx40、Cx43的表達則明顯增加(P<0.05，圖2)。

2.4家兔心房組織Cx40、Cx43蛋白的定量分析Western blot檢測結果與Real-time PCR結果一致。老年組Cx40表達較青年組減低(P<0.01，n=8)，Cx43表達亦下降(P<0.01)；卡托普利干預后，Cx40和Cx43蛋白的表達較未干預組則均有所回升(P<0.05，圖3)。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增長Pmax延長，Pd增大。Pmax增加表明心房內或心房間傳導時間延長，標志著心房內傳導紊亂[4]；而Pd是心房非均質電活動的離散程度的反映，用來預測房性心律紊亂，尤其是房顫[5-6]。本研究結果提示，心房內激動傳導速度隨著年齡增長而顯著減慢，說明心房興奮傳導條件隨年齡增加而惡化，均可作為房顫的預測指標，說明在老齡階段較易發(fā)生房顫。

圖2 Cx40、Cx43 mRNA相對表達量的比較

圖3 各組Cx40、Cx43蛋白表達量的比較

近年來，大量研究顯示RAS的激活與房顫的發(fā)生、維持密切相關[7]。AngⅡ是RAS最主要的活性產(chǎn)物。GOETTE等[8]研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者局部心房組織AngⅡ水平是普通竇性心律患者的3倍。心肌組織中AngⅡ含量增高， 被認為是房性心律失常發(fā)生的重要誘發(fā)因素[9]。隨著對房顫發(fā)生機制研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)AngⅡ不僅可導致 ERP 明顯縮短，參與促進了心房的電重構；而且AngⅡ還能與ATl結合后，通過激活各種磷脂酶及絲裂原活化蛋白酶(MAPK)，誘導生長相關的轉錄因子過度表達，從而引起心臟的間質增生，最終使心房發(fā)生結構重構[10]。以上這些改變都是構成AF發(fā)生的重要基礎。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著增齡，心房組織AngⅡ的含量增加，提示AngⅡ介導的心房重構可能參與了增齡性房顫的發(fā)生。

房顫發(fā)生與維持的經(jīng)典機制是折返機制，心房傳導速度減慢和(或)心房不應期縮短,可能是心房內折返形成的基礎。增強組織的興奮性或減少電流阻力均可以提高心肌的傳導速度。細胞間縫隙連接作為細胞間的一種特殊通道介導著細胞間電和化學信號的傳遞，在維持電和機械偶聯(lián)，以及確保心肌協(xié)調收縮方面起著重要作用[11]。各種病理改變引起的縫隙連接蛋白的分布、表達量以及種類的變化都可以引起傳導速度和傳導各向異性發(fā)生改變，這就為心律失常的發(fā)生提供了基礎[12]。心房肌細胞間縫隙連接主要由Cx40、Cx43構成。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著增齡心房組織中Cx43和Cx40的表達逐漸減少。增齡引起心房肌Cx表達降低，導致細胞間電耦聯(lián)性的進一步下降，改變了心肌的電傳導性，使傳導速度減慢或發(fā)生傳導阻滯的程度加重，易于形成折返，折返的普遍存在，促成多子波折返的出現(xiàn)，為AF的發(fā)生提供基質[13]。

大量的臨床研究表明，RAS阻斷劑血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)可以預防房顫的發(fā)生[14]。其機制可能與ACEI/ARB抑制心房局部及循環(huán)中AngⅡ的分泌和活性，減輕心房結構重構和電重構，進而減少了房顫的發(fā)作[15]。本研究結果顯示，老年家兔采用卡托普利進行干預后，體表心電圖Pa以及Pd均縮短，心房組織AngⅡ濃度降低，Cx40、Cx43 mRNA以及蛋白表達增加。已有研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ含量長期升高可能通過激活 ERK通路的ERK1/2，最終導致心肌纖維化和Cx40重構[16]。通過基因治療增加心房組織Cx40、Cx43的表達可以維持心房的傳導速度，預防房顫的發(fā)生[17]。因此，我們推測卡托普利可以通過減少心房組織AngⅡ濃度，減輕心房Cx的重構，從而改善了細胞間的耦聯(lián)和傳導，使心房的傳導時間以及非均質電活動的離散程度縮短，消除了折返性心律失常的病理基礎，最終可能發(fā)揮防治增齡性房顫的作用。本研究結果為增齡性房顫的發(fā)生機制及防治提供了一定的理論基礎。

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