溫泉中降解纖維素嗜熱細(xì)菌的分離與鑒定

梅凡+林白雪（等）

摘要：采用純培養(yǎng)的方法，從美國內(nèi)達(dá)華州溫泉和中國福建永泰溫泉分離得到27株嗜熱細(xì)菌，從中篩選得到產(chǎn)纖維素酶的嗜熱細(xì)菌并進(jìn)行了16S rDNA鑒定。結(jié)果表明，LY7和LY8是產(chǎn)纖維素酶的嗜熱細(xì)菌，菌株LY7與脂環(huán)酸芽孢桿菌屬（Alicyclobacillus）的同源性達(dá)到99%，菌株LY8與土芽孢桿菌屬（Geobacillus）的同源性達(dá)到99%，生長溫度范圍在40～70 °C之間，最適溫度65 °C。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，LY8的內(nèi)切酶酶活高達(dá)145 IU/mL。

關(guān)鍵詞：溫泉；嗜熱細(xì)菌；熱穩(wěn)定纖維素酶；分離；鑒定

中圖分類號：Q939.9；Q93-331 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1516-04

Isolation and Identification of Thermophiles Degrading Cellulose in Hot Spring

MEI Fan1a，1b，LIN Bai-xue1a，ZHAO Chao1a，1b，LIU Bin1a，1b，2

（1a.College of Food Science；1b.Institute of Bioenergy， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China；

2.China National Engineering Research Center of Juncao Technology， Fuzhou 350002， China）

Abstract： Culture-based approach was used to isolate thermophiles from hot spring. In total， 27 thermophilic bacterial strains were isolated from hot springs in Nevada of USA and Yongtai hot spring in Fujian province of China. Superior cellulose and hemicellulose decomposing strains were screened and identified by 16S rDNA. The results showed that LY7 and LY8 degrading cellulose were indentified as Alicyclobacillus sp. LY7 and Geobacillus sp. LY8. Geobacillus sp. LY8 could be cultured at temperature ranging from 40 ℃ to 70 ℃， with the optimal temperature of 65 ℃. The β-glucosidase activity of LY8 was 145 IU/mL.

Key words： hot spring； thermophiles； thermostable cellulase； separation； identification

纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱。根據(jù)酶的功能差異分為三類：①內(nèi)切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）；②外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91）；③β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）[1，2]。纖維素酶降解纖維素是酶系各組分之間協(xié)同作用的結(jié)果。首先由內(nèi)切葡聚糖酶在纖維素分子內(nèi)部非結(jié)晶區(qū)進(jìn)行隨機(jī)的酶切產(chǎn)生小分子的纖維素，然后由外切葡聚糖酶以纖維二糖為單位從纖維素線性末端進(jìn)行水解，每次切下一個纖維二糖分子，最后由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖以及短鏈纖維寡糖水解成葡萄糖[3-5]。

嗜熱菌是一類能在45 ℃以上生長和繁殖的極端環(huán)境微生物，包括部分細(xì)菌、古菌和真菌三大類，通常分布在地?zé)岘h(huán)境和人工高溫環(huán)境中，如溫泉、地?zé)釁^(qū)土壤、深?；鹕娇?、深海熱液區(qū)以及高溫堆肥、熱水器等環(huán)境[6]。嗜熱菌產(chǎn)生的熱穩(wěn)定酶具有耐熱性、高效性以及對有機(jī)溶劑、去污劑和變性劑的較強(qiáng)抗性，在食品、醫(yī)藥、生物質(zhì)能源、生物工程及廢物處理等方面都得到廣泛的應(yīng)用[7]。其中，熱穩(wěn)定的纖維素酶在纖維素的轉(zhuǎn)化中有著重要的應(yīng)用價值。研究表明，許多高溫菌具有分解纖維素的能力，如芽孢桿菌屬（Bacillus）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、脫硫腸狀菌屬（Desulfotomaculum）、熱酸桿菌屬的解纖維素?zé)崴釛U菌（Acidothermus cellulolyticus）、喜熱菌屬（Caloramator）的厭氧和分解纖維素高溫菌NA10菌株[8]。由于高溫有利于纖維素的降解，而高活力熱穩(wěn)定的纖維素酶更是纖維素酶研究的重要內(nèi)容。因此，研究采用純培養(yǎng)的方法從溫泉樣品中篩選出能降解纖維素的耐熱性菌株并進(jìn)行了16S rDNA鑒定，為在常溫條件下獲得有價值的熱穩(wěn)定性強(qiáng)的酶奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

溫泉樣品：大盆地溫泉和大沸泉，溫度42.5～97.0 ℃，取自美國內(nèi)達(dá)華州；42～70 ℃溫泉樣品，取自福建福州永泰。菌株Escherichia coli DH5α為福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 嗜熱細(xì)菌的分離 將泥樣和水樣混合均勻后，以500 r/min離心2 min，去除大顆粒的雜質(zhì)，然后以10 000 r/min離心10 min，獲得菌體沉淀。水樣可以直接利用。處理后的樣品分別置于4 ℃冰箱和-70 ℃超低溫冰箱。取處理好的樣品加適量無菌生理鹽水稀釋，取100 μL涂布于ZoBell 2216E或者TIM改良后的TM固體培養(yǎng)基上，置于不同溫度的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中培養(yǎng)。挑取單個菌落進(jìn)行劃線分離，反復(fù)分離至單一菌落。

1.2.2 嗜熱菌全菌蛋白分析 將提取純化得到的嗜熱菌全菌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，挑選具有不同電泳帶型的嗜熱菌菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3 降解纖維素嗜熱菌的篩選 將純化得到的嗜熱菌分別點種于纖維素篩選平板上，置于合適的溫度下培養(yǎng)1～2 d。用0.1%剛果紅染色0.5 h，再用1 mol/L NaCl溶液脫色0.5 h，挑選有透明圈的菌落，測量透明圈直徑，進(jìn)行初篩。復(fù)篩采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于120 r/min下培養(yǎng)36 h，測定發(fā)酵液酶活[9，10]。

1.2.4 16S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增和鑒定 用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取嗜熱菌基因組DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將回收后的16S rDNA片段與pMD18-T vector 在16 ℃連接過夜，再轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α中。將提取得到的質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶和BamH I限制性內(nèi)切酶在37 ℃反應(yīng)3～4 h，取適量酶切產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，分析插入片段的大小，確定克隆是否成功[11]。

1.2.5 序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析 陽性克隆的測序由北京天根生物科技公司完成。核酸序列相似性分析采用美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）提供的比對搜索工具BLAST（Basic local alignment search tool， BLAST）進(jìn)行搜索（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。用Clustal X（1.83）進(jìn)行序列比對，采用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱菌的分離純化和菌株分型

每個樣品經(jīng)過處理后，涂布于嗜熱菌分離培養(yǎng)基ZoBell 2216E或者TIM改良后的TM固體培養(yǎng)基上，分別在53 、60 、65 、70 、85 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過多次劃線分離純化得到27株嗜熱菌菌株。

部分嗜熱菌的菌落形態(tài)如表1所示。已純化的嗜熱細(xì)菌菌株采用甘油法保存于-70 ℃冰箱。

采用嗜熱菌全菌蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳（圖1）對27株嗜熱菌進(jìn)行初步篩選。挑選具有不同電泳帶型的嗜熱菌菌株進(jìn)行下一步的研究。

2.2 降解纖維素嗜熱菌的篩選與鑒定

2.2.1 產(chǎn)纖維素酶嗜熱菌的篩選 采用剛果紅染色法從永泰溫泉篩選到兩株具有較強(qiáng)纖維素降解能力的菌株LY8和LY7，對這兩株菌株的形態(tài)進(jìn)行觀察，并進(jìn)行鑒定。

2.2.2 產(chǎn)纖維素酶嗜熱菌的形態(tài)特征 兩株菌株都是桿狀、有芽孢的革蘭氏陽性菌，菌落均是白色。LY7沒有鞭毛，LY8有鞭毛（表2）。

2.2.3 降解纖維素嗜熱菌的酶活活性 纖維素酶根據(jù)酶的功能的差異可分為三類：內(nèi)切葡聚糖酶（EG），外切葡聚糖酶（CBH），β-葡萄糖苷酶（BGL）。如圖2所示，LY8內(nèi)切葡聚糖酶活性高達(dá)145 IU/mL。

2.3 降解纖維素嗜熱菌的鑒定

2.3.1 產(chǎn)纖維素酶嗜熱菌的16S rDNA鑒定 將LY7和LY8接種液體培養(yǎng)基，65 ℃培養(yǎng)36 h后離心收集菌體，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取這兩株嗜熱菌的基因組DNA。用細(xì)菌通用引物Euba27F和Euba1492R進(jìn)行16S rDNA 的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約1 500 bp，結(jié)果見圖3。

將純化回收的16S rDNA PCR產(chǎn)物與pMD 18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，雙酶切驗證后（圖4）送北京天根生物科技公司測序。

2.3.2 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析 LY7和LY8的16S rDNA測序結(jié)果表明，菌株LY7的16S rDNA為1 531 bp，菌株LY8的16S rDNA為1 552 bp。用BLAST在NCBI中搜索同源序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果（圖5）顯示，菌株LY7屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬（Alicyclobacillus），菌株LY8屬于土芽孢桿菌屬（Geobacillus），生長溫度為40～70 ℃，最適溫度65 ℃。

3 小結(jié)與討論

本研究以纖維素為底物，從美國內(nèi)達(dá)華州溫泉和中國福建永泰溫泉分離得到兩株產(chǎn)纖維素酶的嗜熱細(xì)菌菌株LY7和LY8，它們的最適反應(yīng)溫度為65 ℃，而目前文獻(xiàn)中報道的纖維素降解菌株最適溫度為30 ℃左右，因此本研究篩選的菌株可在很多工業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。嗜熱細(xì)菌LY8的酶活最高，其內(nèi)切葡聚糖酶活性最高達(dá)145 IU/mL，與文獻(xiàn)報道的產(chǎn)內(nèi)切葡聚糖酶活性較高的幾株菌株（綠色木霉C-08最高酶活為89 IU/mL[12]、里氏木霉40359最高酶活100 IU/mL[13]）相比，可知嗜熱細(xì)菌LY8內(nèi)切酶活性最高。雖然目前工業(yè)上纖維素酶產(chǎn)生菌Trichoderma reesei工程菌MCG80發(fā)酵酶活為300～500 IU/mL[14]，但嗜熱細(xì)菌LY8作為一株野生菌株，酶活能夠達(dá)到這個水平，說明很有應(yīng)用前景，如果再通過誘變育種很可能成為一個生產(chǎn)菌株，而且其可在高溫范圍降解纖維素，有著常溫細(xì)菌不可比擬的優(yōu)勢。通過16S rDNA序列鑒定，LY8屬于土芽孢桿菌屬（Geobacillus），LY7屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬（Alicyclobacillus）。由于真菌降解纖維物質(zhì)主要是通過分泌大量的胞外酶來進(jìn)行的，因此纖維素降解真菌在纖維素酶的開發(fā)和應(yīng)用上具有細(xì)菌、放線菌等所不具有的優(yōu)勢。然而，本研究的細(xì)菌體內(nèi)存在著獨特的耐高溫代謝途徑和耐高溫酶，如果通過分子生物學(xué)方法克隆這些耐高溫酶的基因，并使其在畢赤酵母等真菌宿主中進(jìn)行表達(dá)，就可以在常溫條件下獲得有價值的熱穩(wěn)定性強(qiáng)的酶，因此具有極高的研究和應(yīng)用價值。

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