黃芩苷聯(lián)合NB-UVB對黑素細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響

姚 蕾,鐘淑霞,蘭珊珊,宋 洋,周俊峰,李珊山

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科,吉林長春 130021)

黃芩苷聯(lián)合NB-UVB對黑素細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響

姚 蕾,鐘淑霞,蘭珊珊,宋 洋,周俊峰,李珊山

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科,吉林長春 130021)

目的:觀察體外培養(yǎng)的人正常黑素細(xì)胞經(jīng)黃芩苷和窄波紫外線(NB-UVB)處理后細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的變化,為白癜風(fēng)的新療法研究提供理論依據(jù)。方法:人正常黑素細(xì)胞分為空白對照組、不同濃度黃芩苷組、不同劑量NB-UVB組及黃芩苷和NB-UVB聯(lián)合組。應(yīng)用MTT法檢測各組黑素細(xì)胞增殖率,應(yīng)用NaOH裂解法測定黑素水平,應(yīng)用多巴氧化法測定酪氨酸酶活性。結(jié)果:與空白對照組比較, 1×10－4mol·L－1黃芩苷及30 mJ·cm－2NB-UVB組黑素細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與空白對照組比較,黃芩苷組、NB-UVB組及聯(lián)合組黑素水平及酪氨酸酶活性均增加(P＜0.05或P＜0.01);與黃芩苷組和NB-UVB組比較,聯(lián)合組黑素水平和酪氨酸酶活性均增加(P＜0.01)。結(jié)論:黃芩苷與NB-UVB聯(lián)合應(yīng)用較2種方法單獨(dú)應(yīng)用具有更好的促黑素合成效果。

黑素細(xì)胞;黃芩苷;窄波紫外線;黑素;酪氨酸酶

白癜風(fēng)為常見的色素脫失性皮膚病,病因復(fù)雜,治療困難[1]。窄波UVB(narrow band-UVB, NB-UVB)由于其不良反應(yīng)小、療效顯著而廣泛用于白癜風(fēng)的治療。中藥黃芩(Radix Scutellariae)為唇形科多年草本植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的根,中醫(yī)常用來治療白癜風(fēng)。已有報(bào)道[2-4]證實(shí):黃芩具有促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞及黑素細(xì)胞黑素合成的作用,但黃芩與NB-UVB聯(lián)合應(yīng)用對黑素細(xì)胞影響的研究尚少。本研究觀察黃芩苷聯(lián)合NB-UVB對體外培養(yǎng)的人正常黑素細(xì)胞增殖、黑素生成及酪氨酸酶活性的影響,以期為白癜風(fēng)的新療法研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑黃芩苷(相對分子質(zhì)量446.37)、EDTA和二甲基亞砜(DMSO)等均購自美國Sigma公司,F12培養(yǎng)液、胰酶、PBS和胎牛血清等均購自美國Invitrogen公司,左旋多巴購自百靈威公司,Triton X-100購自美國Amerisco生物公司,黑素細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑堿性成纖維細(xì)胞長生因子(bFGF)購自美國Peprotech公司,IBMX購自美國Sigma公司。

1.2 原代黑素細(xì)胞培養(yǎng)取小兒包皮環(huán)切術(shù)后標(biāo)本(吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科提供),去除皮下組織后分割成0.5 cm×1.0 cm條形組織塊,胰酶4℃消化過夜;分離表皮與真皮,將細(xì)胞刮下,吹打成細(xì)胞懸液,離心后計(jì)數(shù),以(6～8)× 106m L－1的密度接種于12.5 cm2培養(yǎng)瓶中,采用Hu16培養(yǎng)基[5]。24 h后換液,培養(yǎng)第3天加入G-418除去角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞,1周后可得到純黑素細(xì)胞。待細(xì)胞生長至80%融合傳代,同時(shí)進(jìn)行多巴染色鑒定。取第3～4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、不同濃度黃芩苷組、不同劑量NB-UVB組及黃芩苷和NB-UVB聯(lián)合組。黃芩苷組黃芩苷終濃度分別為1×10－4mol·L－1(0.04 g·L－1)、1× 10－3mol·L－1(0.4 g·L－1)和1× 10－2mol·L－1(4 g·L－1);NB-UVB組UVB劑量分別為30、60、90和120 mJ·cm－2。選取不影響黑素細(xì)胞生長的黃芩苷濃度及UVB劑量聯(lián)合作為聯(lián)合組。

1.4 MTT法檢測黑素細(xì)胞增殖黃芩苷組:將培養(yǎng)至第3代的黑素細(xì)胞接種于96孔板,每孔5×103個細(xì)胞,24 h后換液,加人含黃芩苷的培養(yǎng)液(終濃度為1×10－4、1×10－3和1× 10－2mol·L－1,并設(shè)空白對照)。繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后,棄上清,每孔加入1 g·L－1MTT溶液,4 h后吸出液體,每孔加入DMSO 100μL,于酶標(biāo)儀490 nm波長處測定各孔吸光度(A490)值,每個濃度重復(fù)3次。

NB-UVB組:隔日照射1次,共3次(劑量分別為30、60、90和120 mJ·cm－2,并設(shè)空白對照)。光源距細(xì)胞培養(yǎng)板10 cm,照射完畢后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄上清,每孔加入1 g·L－1的MTT溶液,4 h后吸出液體,每孔加入DMSO 100μL,于酶標(biāo)儀490nm波長處測定各孔A490值,每個劑量重復(fù)3次。

計(jì)算細(xì)胞增殖率,細(xì)胞增殖率＝處理組A490值/空白對照組A490值×100%。選取對黑素細(xì)胞生長無影響的黃芩苷濃度及NB-UVB劑量聯(lián)合處理黑素細(xì)胞作為聯(lián)合組,檢測其黑素水平及酪氨酸酶活性。

1.5 黑素水平的檢測采用NaOH裂解法測定各組細(xì)胞黑素水平。將細(xì)胞接種于6孔板,每孔1× 104個細(xì)胞,取各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后,胰蛋白酶消化脫皿,離心后去上清,加入1 mol·L－1NaOH 于475 nm波長處測定A475值,對照黑素標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出黑素水平。黑素水平＝實(shí)驗(yàn)組A475值/空白對照組A475值×100%。

1.6 酪氨酸酶活性的檢測細(xì)胞接種于96孔板,每孔5×103個細(xì)胞,24 h后換液,細(xì)胞分組方法同上。細(xì)胞分組處理結(jié)束后PBS洗滌2次,加入100μL 1%Triton X-100,震蕩5 min后每孔加入0.1%L-Dopa 100μL,同時(shí)使用L-Dopa的自動氧化進(jìn)行校正,37℃孵育30 min,于酶標(biāo)儀490 nm波長處測定A490值。酪氨酸酶活性＝實(shí)驗(yàn)組A490值/空白對照組A490值×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組黑素細(xì)胞增殖率、黑素水平和酪氨酸酶活性以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組黑素細(xì)胞增殖率與空白對照組比較, 1×10－4mol·L－1黃芩苷組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),1×10－3及1×10－2mol·L－1黃芩苷組黑素細(xì)胞增殖率明顯降低(P＜0.01),見表1。與空白對照組比較,30 mJ·cm－2NB-UVB組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),60、90和120 mJ·cm－2NB-UVB組黑素細(xì)胞增殖率明顯降低(P＜0.05或P＜0.01),見表2。因此取黃芩苷濃度10－4mol·L－1及NB-UVB劑量30 mJ·cm－2為處理?xiàng)l件測定黑素細(xì)胞黑素水平及酪氨酸酶活性。

表1 不同濃度黃芩苷作用下黑素細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of melanocytes after treated with different concentrations of baicalin(n＝3,±s,η/%)

表1 不同濃度黃芩苷作用下黑素細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of melanocytes after treated with different concentrations of baicalin(n＝3,±s,η/%)

?P＜0.05 compared with blank control group.

Group Proliferation rate Blank control 100.00±0.00 Baicalin(mol·L－1) 10－493.84±10.96 10－362.55±5.94?10－218.19±4.31?

表2 不同劑量NB-UVB照射后黑素細(xì)胞增殖率Tab.2 Proliferation rates of melanocytes after treated with different doses of NB-UVB(n＝3,±s,η/%)

表2 不同劑量NB-UVB照射后黑素細(xì)胞增殖率Tab.2 Proliferation rates of melanocytes after treated with different doses of NB-UVB(n＝3,±s,η/%)

?P＜0.05,??P＜0.01 compared with blank control group.

Group Proliferation rate Blank control 100.00±0.00 NB-UVB(mJ·cm－2) 30 100.19±5.87 60 75.53±7.04?90 51.33±9.54?120 13.88±4.73??

2.2 各組黑素細(xì)胞中黑素水平與空白對照組比較,黃芩苷組、NB-UVB組及聯(lián)合組黑素細(xì)胞中黑素水平均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或P＜0.01),聯(lián)合組黑素水平與黃芩苷組及NB-UVB組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表3。

2.3 各組黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性黃芩苷組及NB-UVB組黑素細(xì)胞中酪氨酸酶活性與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01),聯(lián)合組酪氨酸酶活性與黃芩苷組及NBUVB組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表3。

3 討論

白癜風(fēng)的治療以促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖及黑素合成為主要目標(biāo),酪氨酸酶是黑素合成的限速酶,其表達(dá)及活性影響黑素生成的速度及產(chǎn)量[6],因此如能有效增加黑素細(xì)胞酪氨酸酶的活性,則可提高白癜風(fēng)的治療效果。

表3 各組黑素細(xì)胞中黑素水平和酪氨酸酶活性Tab.3 Melanin levels and tyrosinase activities in melanocytes in various groups(±s,η/%)

表3 各組黑素細(xì)胞中黑素水平和酪氨酸酶活性Tab.3 Melanin levels and tyrosinase activities in melanocytes in various groups(±s,η/%)

?P＜0.05,??P＜0.01 compared with blank control group;△P＜0.01compared with baicalin group;＃P＜0.01 compared with NB-UVB group.

Group Melanin Tyrosinase activity Blank control 100.00±9.00 100.00±0.00 Baicalin 134.14±7.14?125.22±6.01?NB-UVB 133.98±9.30?143.69±8.92?Combined 277.49±10.17??△＃255.26±25.98??△＃

NB-UVB是臨床治療白癜風(fēng)的可靠方法[7-9],但體外實(shí)驗(yàn)多表明大劑量的NB-UVB照射會導(dǎo)致黑素細(xì)胞增殖活性降低。國內(nèi)王奕等[10]報(bào)道:體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞在接受≥60 mJ·cm－2的NB-UVB照射后呈負(fù)增殖,而黑素合成則隨NBUVB劑量增加呈劑量依賴式遞增;朱建偉等[11]的研究也證明:體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞在接受60～90 mJ·cm－2的UVB照射后細(xì)胞受損。根據(jù)Hu[12]的報(bào)道:黑素細(xì)胞在衰老及接近死亡時(shí)黑素生成會明顯增加,因此若探討對黑素細(xì)胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響,使用對黑素細(xì)胞增殖活性無影響的NB-UVB劑量才是可靠的。本研究結(jié)果表明:當(dāng)NB-UVB劑量為30 mJ·cm－2時(shí)細(xì)胞生長未受抑制,而增加劑量后黑素細(xì)胞生長受抑,因此選用該劑量進(jìn)行后續(xù)研究。

黃芩苷對黑素細(xì)胞增殖及黑素合成影響的報(bào)道很少。國內(nèi)學(xué)者羅增香等[2]報(bào)道:5～160 mg·L－1黃芩苷對共培養(yǎng)體系中的黑素細(xì)胞增殖無抑制作用,而10～40 mg·L－1黃芩苷促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示:黃芩苷濃度為1× 10－4mol·L－1(0.04 g·L－1)時(shí)對黑素細(xì)胞生長無影響,但濃度為1×10－3mol·L－1及1× 10－2mol·L－1時(shí)則抑制黑素細(xì)胞增殖,說明高濃度黃芩苷仍會對黑素細(xì)胞造成損傷。本研究結(jié)果也顯示:對黑素細(xì)胞增殖無影響的黃芩苷濃度可促進(jìn)黑素合成及增加酪氨酸酶活性,說明低濃度黃芩苷可安全有效地增強(qiáng)黑素細(xì)胞功能。

關(guān)于黃芩苷聯(lián)合NB-UVB對黑素細(xì)胞功能的影響并與單獨(dú)應(yīng)用黃芩苷或單獨(dú)應(yīng)用NB-UVB照射進(jìn)行比較的研究尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示:1×10－4mol·L－1黃芩苷與30 mJ·cm－2NB-UVB照射聯(lián)合應(yīng)用可明顯提高黑素細(xì)胞中黑素水平及酪氨酸酶活性,且與單獨(dú)黃芩苷組及單獨(dú)NB-UVB組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有學(xué)者[13]研究表明:體外培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞接受高劑量NB-UVB照射時(shí)黃芩苷可起到保護(hù)作用,可使黑素細(xì)胞耐受更高劑量的NB-UVB照射而增殖活性不受影響。因此應(yīng)用黃芩苷后是否可聯(lián)合應(yīng)用更大劑量的NB-UVB照射來促進(jìn)黑素細(xì)胞合成黑素可作為下一步研究的重點(diǎn)。本研究初步證明:黃芩苷與NB-UVB聯(lián)合應(yīng)用較2種方法單獨(dú)應(yīng)用具有更好的促黑素合成的作用,本研究結(jié)果為黃芩苷聯(lián)合UB-UVB治療白癜風(fēng)提供了理論依據(jù)。

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Influence of baicalin combined with NB-UVB on melanin synthesis and tyrosinase activity in melanocytes

YAO Lei,ZHONG Shu-xia,LAN Shan-shan,SONG Yang,ZHOU Jun-feng,LI Shan-shan
(Department of Dermatology,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo observe the synthesis of melanin and tyrosinase activity of the cultured normal human melanocytes after treated with baicalin and NB-UVB,and to provide theoretical evidence for study on the new therapy method of vitiligo.MethodsThe normal human menlanocytes cultured in vitro were divided into control group,different concentrations of baicalin groups,different doses of NB-UVB group and baicalin combined NBUVB group.The proliferation rate of melanocytes was measured by MTT assay,the level of melanin was tested by NaOH pyrolysis,and the tyrosinase activity was measured by dopa oxidization.ResultsCompared with control group,the proliferation rates in 10－4mol·L－1baicalin group and 30 mJ·cm－2NB-UVB group had no significant difference(P＞0.05).Compared with control group,the levels of melanin and tyrosinase activities in baicalin group,NB-UVB group and combined group were increased(P＜0.05 or P＜0.01);compared with baicalin group and NB-UVB group,the level of melanin and tyrosinase activity in combined group were increased(P＜0.01).ConclusionBaicalin combined with NB-UVB has better promotion effect on melanin synthesis than used alone.

melanocytes;baicalin;narrwo band-UVB;melanin;tyrosinase

R285;R75

A

2013-11-26

吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(20110478);吉林省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目資助課題(2006)

姚 蕾(1983－),女,黑龍江省大慶市人,醫(yī)學(xué)碩士,主要從事白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制及治療方面的研究。

李珊山(Tel:0431-88782615,E-mail:shansalee＠163.com)

時(shí)間: 2014-08-27 14:44

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1444.004.html

1671-587Ⅹ(2014)05-1024-04

10.13481/j.1671-587x.20140523