• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    一步重組法構(gòu)建產(chǎn)龍膽苦苷酵母重組菌的研究

    2014-06-27 03:51:42錢衛(wèi)東趙德志付云芳陳雪峰毛培宏周穎欣謝海艷
    陜西科技大學(xué)學(xué)報 2014年5期
    關(guān)鍵詞:離子注入秦艽龍膽

    錢衛(wèi)東, 趙德志, 付云芳,陳雪峰, 毛培宏,周穎欣, 常 凱, 謝海艷

    (1.陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021; 2.新疆大學(xué) 物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 離子束生物技術(shù)中心, 新疆 烏魯木齊 830046)

    0 引言

    龍膽苦苷(Gentiopicroside),別名龍膽苦甙,分子式為C16H20O9,分子量為356.11,為裂環(huán)環(huán)烯萜苷類化合物,屬于倍半萜類物質(zhì),是藥用植物秦艽(Gentianamacrophylla)的主要藥用成分[1].近年來的研究表明,龍膽苦苷具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽、健胃抗?jié)兊茸饔?,如作為國家一類新藥注射用秦龍苦素,為秦艽提取物龍膽苦苷的凍干粉針,用于黃疸型病毒性肝炎的治療[2-4].隨著人們對龍膽苦苷藥用價值的肯定,開發(fā)和生產(chǎn)以龍膽苦苷為原料的藥品越來越多,使得臨床上對龍膽苦苷的需求量日益增加.

    龍膽苦苷多來源于龍膽科多年生草本植物秦艽.值得注意的是,秦艽藥材由于使用范圍不斷擴大,市場需求量逐年增加,致使野生資源急劇下降,已被列入國家三級保護野生藥材[5].又因為秦艽存在適生地窄、栽培困難、生長周期長等問題,造成目前市場上秦艽資源短缺,供需矛盾非常突出.

    與國外相比而言,國內(nèi)近年來對龍膽苦苷來源的研究相對較多.Tiwari和Zhang 等運用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobaeteriumrhizogenes)誘導(dǎo)出秦艽毛狀根,但未篩選出產(chǎn)龍膽苦苷的毛狀根[6-7].齊香君等運用秦艽懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)龍膽苦苷,產(chǎn)量僅為0.242 mg/g[8].上述結(jié)果表明,利用毛狀根或懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)龍膽苦苷目前都未能獲得理想的結(jié)果.

    因此,研究和開發(fā)秦艽新資源、解決龍膽苦苷來源短缺問題亟需尋求其它藥源途徑和新的研究方法.近年來,代謝工程因其在尋求新型藥源和藥源種質(zhì)改良方面具有獨特優(yōu)勢,已經(jīng)逐漸成為當今國際生藥學(xué)界的研究熱點之一[9-12].

    目前,關(guān)于秦艽藥用成分龍膽苦苷的生物合成相關(guān)基因的研究報道較少.趙鵬等分離克隆了3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreductase,HMGR)基因家族的兩條基因和G10H 基因家族的一條基因,但其僅對HMGR和G10H 基因進行了序列分析,而沒有利用基因敲除/遺傳互補方法在體內(nèi)進行功能鑒定.在龍膽苦苷生物合成基因尚未闡明前,亟需尋求新思路構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物工程菌.近年來,由我國學(xué)者自主開發(fā)的離子束介導(dǎo)藥用植物基因組總DNA轉(zhuǎn)化微生物、構(gòu)建產(chǎn)藥用植物天然藥用成分重組菌株的技術(shù),為利用微生物合成龍膽苦苷提供了技術(shù)支持[13,14].

    1 材料和方法

    1.1 菌種

    多形漢遜酵母(HansenulapolymorphaH.polymorpha) DL-1菌株(來源為ATCC No.26012).

    1.2 培養(yǎng)基

    (1)YPD固體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20 g,酵母膏10 g,蛋白胨20 g,瓊脂粉15 g,pH 6.5.

    (2)種子液培養(yǎng)基(g/L) :葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母膏10 g,pH 6.5.

    (3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L): 丙三醇15 g,(NH4)2SO415 g,K2HPO40.24 g,MgSO4·7H2O 1.8 g,CaCl20.28 g,NaCl 0.6 g,NaNO30.58 g,F(xiàn)eCl3SO4·6H2O 0.006 g,硫胺素鹽酸鹽0.004 g,微量元素母液1 mL.

    其中,微量元素母液(mg/L):Na2MoO4·2H2O 484 mg,MnSO4·H2O 176 mg,KI 207.5,CuSO4·5H2O 40 mg,ZnSO4·7H2O 40 mg,pH為6.5.

    1.3 主要試劑和儀器

    龍膽苦苷標準品(美國Sigma公司);酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、CMC-Na、硅膠GF254、香草醛、醋酸鋰等(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);Tris-Hcl、十二烷基硫酸鈉(SDS) 、EDTA 、Tris飽和酚等(拜爾迪公司).

    臺式冷凍離心機(Sigma);高效液相色譜儀(美國Waters);Ddevic 1多功能離子注入機(IBB).

    1.4 試驗方法

    1.4.1 秦艽的基因組DNA的提取

    秦艽新鮮葉片采自陜西省太白縣秦艽種植基地.取其新鮮葉片約5 g置于研缽中,用液氮冷凍研磨至粉末,加入3.5 mL、2%(質(zhì)量分數(shù))、65 ℃預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液,輕輕搖勻后分裝在1.5 mL EP管中(約1 mL/管),置于65 ℃的水浴鍋中溫育,每隔10 min輕搖一次,溫育40 min.取出后,冷卻2 min,加入0.5 mL氯仿-異戊醇(24∶1,v/v),漩渦振蕩2 min,然后,10,000 r/min離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至裝有600μL異丙醇的EP管中,將離心管上下輕輕搖動30 s,使異丙醇與水層充分混合.

    10,000 r/min離心2 min后,去掉上清液,自然風干,然后加入720μL的75%乙醇及80μL 5 mol/L的醋酸鈉,輕輕搖勻;10,000 r/min離心1 min后,倒掉上清液,加入800μL 75%(體積分數(shù))的乙醇,輕輕搖勻后,10,000 r/min離心30 s后,倒掉上清液,將離心管自然風干;再加入50μL 0.5×TE(含RNase)緩沖液,使DNA溶解,置于37 ℃恒溫箱約15 h.置于-20 ℃保存、備用.

    1.4.2 酵母菌膜的制備

    取酵母菌母液100μL轉(zhuǎn)接到裝有2 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中,37 ℃,110 r/min培養(yǎng)16~18 h,取菌體用保護液(葡萄糖0.5%+可溶性淀粉0.5%)稀釋,采用血球計數(shù)板計數(shù)法確定稀釋倍數(shù),稀釋至細胞濃度為1.0×106CFU/mL,并取0.1 mL菌體稀釋液將其均勻涂布于直徑90 mm的無菌平皿中央,用無菌風吹干制成菌膜.

    1.4.3 最佳離子注入能量和劑量的探索

    根據(jù)試驗需要,設(shè)置不同的離子注入能量與劑量的組合,進行多次重復(fù)試驗,探索最佳的離子注入?yún)?shù),參數(shù)設(shè)計為:能量分別是a:30 keV;b:25 keV;c:20 keV,注入劑量(ions/cm2)如表1所示.

    表1 試驗中N+注入劑量

    將菌膜平皿置于離子注入機真空靶室中央進行N+注入,按照a、b、c的能量和表1中的低能離子注入劑量注入.注入結(jié)束后,立即將2 mL不含基因組的TE溶液迅速倒入注入過的菌膜平皿中,置于 37 ℃恒溫箱中溫育2 h;然后用無菌刮鏟將菌全部刮下,取0.1 mL菌液均勻涂布于YPD固體培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h.對照菌株做同樣處理,計算存活率.以低能注入劑量為橫坐標,存活率為縱坐標,制備注入曲線,獲得最佳的離子注入能量和劑量.

    1.4.4 構(gòu)建產(chǎn)龍膽苦苷工程菌株

    (1)低能離子注入酵母

    利用上述獲得的最佳低能離子注入能量和劑量進行注入.注入完畢后,立即將2 mL含有秦艽基因組的TE溶液迅速加入經(jīng)低能離子注入過的菌膜平皿中,經(jīng)TE浸泡、溫育、涂固體培養(yǎng)基,在 37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h.取出放入4 ℃冰箱,以備初篩.

    (2)重組菌株的初篩

    將YPD培養(yǎng)基上生長的單菌落接入裝有5 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中,放入37 ℃,160 r/min搖床上培養(yǎng)90 h得發(fā)酵液,將發(fā)酵液7,000 r/min離心15 min,收集上清液用于發(fā)酵產(chǎn)物檢測.由于龍膽苦苷是環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì),因此,主要采用Molish反應(yīng)、香草醛反應(yīng).其操作步驟如下:

    ①Molish反應(yīng).100 ℃下濃縮發(fā)酵液后,加入甲醇10 mL,過濾.取濾液3 mL放入干凈試管中,加入兩滴Molish試劑(10%的α-萘酚醇溶液)搖勻,然后沿試管壁緩慢加入約1 mL濃硫酸,靜置,觀察兩層液面交界處的顏色變化.

    ②香草醛反應(yīng).取樣品濃縮液1 mL加入試管中,再加入0.5 mL、5%(質(zhì)量分數(shù))的香草醛濃硫酸溶液,65 ℃水浴2 min,觀察溶液顏色變化.

    (3)重組菌株的復(fù)篩

    將初篩所得菌株接種于裝有200 mL YPD液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,37 ℃,160 r/min,恒溫培養(yǎng)90 h后,7,000 r/min離心15 min,收集上清液80 ℃濃縮至40 mL,加入20 mL預(yù)冷丙酮萃取,萃取3次,將收集的萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃下蒸干,然后加入5 mL甲醇溶解,獲得樣品溶液,用薄層層析法和高效液相色譜法對產(chǎn)物進行定性和定量分析.

    ①薄層層析法(TLC)定性檢測.將薄層層析用GF254硅膠板放入干燥箱,105 ℃活化30 min.用微量進樣器點樣,在展開劑氯仿-甲醇(4∶1v/v)中展開,結(jié)束后揮發(fā)干展開劑,在紫外燈下觀察,記錄斑點,并計算其Rf值.

    ②高效液相色譜法(HPLC)定量檢測.色譜條件:色譜柱,Diamonsil C18柱(4.6 ×250 mm,5μm);流動相,乙腈:水(40∶60,V/V);紫外檢測器,Waters 2487;檢測波長,274 nm;進樣量,20μL;流速,1.0 mL/min;柱溫,25 ℃.

    1.4.5 遺傳穩(wěn)定性試驗

    將重組菌株依次劃線傳代培養(yǎng)8代,將各代菌株活化后,接種于裝有200 mL YPD培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進行搖瓶培養(yǎng),160 r/min ,37 ℃,恒溫培養(yǎng)90 h后,經(jīng)離心、濃縮、萃取、蒸發(fā)、溶解,制備樣品溶液.對樣品溶液經(jīng)過HPLC進行定量檢測,比較產(chǎn)量.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 最佳低能離子注入能量和劑量

    分別在a、b、c三種能量下,按照表1中的N+注入劑量進行注入.注入后,立即在每個平皿中加入2 mL不含秦艽DNA的TE溶液,37 ℃溫育2 h,用無菌刮鏟刮下薄膜后,經(jīng)平板培養(yǎng)18 h計算存活率,其結(jié)果如表2所示.

    試驗a各組經(jīng)平板培養(yǎng)后,除空白對照組外,都未長出菌落;試驗b平面培養(yǎng)后,除對照組菌落過多之外,其余各組菌落數(shù)均有不同程度地減少,且出現(xiàn)隨著劑量的增加菌落數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象;試驗c經(jīng)平面培養(yǎng)后,出現(xiàn)各組菌落數(shù)均有一定程度減少,但減少幅度較小.

    產(chǎn)生上述結(jié)果的主要原因是:試驗a是由于能量過大在對DNA產(chǎn)生更大傷害的同時,對細胞壁及細胞質(zhì)的刻蝕過于嚴重,產(chǎn)生不可逆的損傷,導(dǎo)致細胞死亡.

    試驗b當以能量為25 keV劑量較低時,注入N+只對細胞表面進行損傷和刻蝕,損傷程度低,易于修復(fù),因此,存活率較高.隨著注入劑量的增加,細胞表面刻蝕嚴重,離子損傷及細胞內(nèi)部產(chǎn)生大量自由基和軟射線等,致使存活率急劇下降;當注入劑量達到20×1015ions/cm2時,存活率下降到最低.隨著注入劑量的增加,可能激活細胞內(nèi)某個修復(fù)機制,導(dǎo)致存活率有小幅度回升,之后隨著離子注入劑量的增加存活率再一次下降(如圖1所示),這一結(jié)論與毛培宏提出的離子注入與生物體的相互作用機理[15]一致.

    試驗c由于能量低,離子對細胞表面損傷和刻蝕程度較輕,經(jīng)過細胞的自我修復(fù),存活率隨著劑量的增加雖有一定程度地降低,但幅度較小.

    表2 菌落存活數(shù)

    經(jīng)過上述試驗確定,N+注入技術(shù)轉(zhuǎn)化H.polymorphaDL-1的最佳條件為:低能離子注入能量,25 keV;劑量,25×1015ions/cm2.10-3真空條件下,脈沖注入10 s,間隔10 s.

    圖1 低能N+注入多形漢遜酵母的存活率曲線

    2.2 初篩結(jié)果分析

    在能量25 keV、注入劑量25×1015ions/cm2、10-3Pa真空條件下,注入后,加入2 mL含秦艽基因組的TE溶液浸泡.37 ℃溫育2 h,將刮下來的菌液接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h,取單菌落活化后接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng),對發(fā)酵產(chǎn)物采用Molish反應(yīng)、香草醛反應(yīng).

    結(jié)果顯示:在2,000多株備選菌株中,有313株的發(fā)酵液在Molish反應(yīng)中有紫環(huán)產(chǎn)生;有173株的發(fā)酵液在香草醛反應(yīng)中試管底部出現(xiàn)棕色或紅色;同時在兩種顏色反應(yīng)中均有相應(yīng)顏色出現(xiàn)的僅有54株.在真空條件下未經(jīng)離子注入的酵母菌在導(dǎo)入秦艽基因組DNA的處理中,未獲得糖苷類或環(huán)烯醚萜類物質(zhì)陽性反應(yīng)的菌株.由此可說明,用低能N+介導(dǎo)將秦艽基因組導(dǎo)入酵母的方法初步認為是可行的,同時也說明了導(dǎo)入外源DNA大分子轉(zhuǎn)化的隨機性和重組菌株的遺傳多樣性.

    2.3 復(fù)篩結(jié)果分析

    經(jīng)過初篩獲得了54株備選菌株,通過發(fā)酵培養(yǎng)、濃縮等,制備樣品溶液.取20 μL各樣品溶液在薄層層析展板上點樣、風干.在展開劑氯仿-甲醇(4∶1,V/V)中展開,結(jié)束后揮發(fā)干展開劑,在紫外燈下觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株的發(fā)酵液斑點與龍膽苦苷的標準品在同一直線上,其Rf值完全相同,均為0.30(如圖2所示),由此可以初步斷定,該菌株為目標重組菌.

    取Rf值一致的樣品溶液0.5 mL,用0.45μm微孔濾膜過濾,以20μL的進樣量,25 ℃柱溫,270 nm波長,1 mL/min流速,進行高效液相色譜(HPLC)分析檢測.對出峰時間和峰面積進行記錄分析,其結(jié)果如圖3所示.重組菌株的發(fā)酵液在高效液相色譜中的出峰時間為12.377 min,與龍膽苦苷標準品的出峰時間12.370 min基本一致,而出發(fā)菌株的發(fā)酵液在該位置未出現(xiàn)峰.

    由上述試驗結(jié)果分析,可以確定該重組菌株為目標菌株,即可以發(fā)酵生產(chǎn)龍膽苦苷的酵母重組菌株.

    1:出發(fā)菌株的發(fā)酵液;2:龍膽苦苷標準品;3:重組菌株的發(fā)酵液圖2 菌株發(fā)酵液的薄層層析圖譜

    (a) 龍膽苦苷標準品HPLC圖譜

    (b) 重組菌株發(fā)酵液HPLC圖譜

    (c) 出發(fā)菌株發(fā)酵液HPLC圖譜圖3 菌株發(fā)酵液的HPLC圖譜

    2.4 產(chǎn)龍膽苦苷的重組菌株的傳代穩(wěn)定性試驗

    將復(fù)篩篩選出的重組菌株活化后接入5 mL YPD培養(yǎng)基中,培養(yǎng)18 h,用甘油保藏菌種,同時傳代培養(yǎng),斜面?zhèn)髦?代,分別對8代菌株進行活化、發(fā)酵培養(yǎng),對發(fā)酵產(chǎn)物進行高效液相色譜分析,比較產(chǎn)量.其結(jié)果如表3所示,各代產(chǎn)量略有變化,但整體基本保持不變.這說明該菌株傳代穩(wěn)定性較好.

    表3 重組菌株的遺傳穩(wěn)定性試驗

    3 結(jié)論

    本試驗利用低能N+注入對多形漢遜酵母進行直接注入誘變,通過存活率繪制出劑量-效應(yīng)曲線,即“馬鞍型”曲線,獲得最佳低能離子注入能量和劑量.利用最佳的低能離子注入能量和劑量注入介導(dǎo)秦艽基因組隨機轉(zhuǎn)化酵母,經(jīng)Molish反應(yīng)和香草醛反應(yīng)對轉(zhuǎn)化子進行初篩,接著利用薄層層析法和高效液相色譜法等對初篩獲得的候選菌株進行復(fù)篩,再結(jié)合遺傳穩(wěn)定性試驗,獲得了1株遺傳穩(wěn)定能生物合成龍膽苦苷的酵母重組菌.

    本試驗結(jié)果表明,利用低能離子注入技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物重組酵母菌株,具有如下優(yōu)點:即在事先不清楚天然產(chǎn)物生物合成途徑及其相關(guān)基因或無需克隆相關(guān)基因構(gòu)建重組質(zhì)粒的情況下,可以實現(xiàn)“一步”構(gòu)建產(chǎn)天然產(chǎn)物的重組酵母菌,為天然產(chǎn)物新藥源的開發(fā)提供了新思路、新方法.另外,人們還可以利用“逆向思維”,將獲得的產(chǎn)天然產(chǎn)物酵母重組菌作為研究對象,依托操作簡便的酵母遺傳操作平臺,深入研究天然產(chǎn)物的生物合成途徑及其相關(guān)基因的功能.

    [1]姚新生.天然藥物化學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:219-232.

    [2]陳 雷,王海波,孫曉麗,等.龍膽苦苷鎮(zhèn)痛抗炎藥理作用研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008,20(5):903-906.

    [3]Chen L,Liu J C,Zhang X N,et al.Down-regulation of NR2B receptors partially contributes to analgesic effects of Gentiopicroside in persistent inflammatory pain[J].Neuropharmacology,2008,54(8):1 175-1 181.

    [4]Deng Y,Wang L,Yang Y,et al.In vitro inhibition and induction of human liver cytochrome P450 enzymes by gentiopicroside: potent effect on CYP2A6[J].Drug Metab Pharmacokinet,2013,28(4):339-344.

    [5]張恩迪,鄭漢臣.中國瀕危野生藥用動植物資源的保護[M].上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社,2000.

    [6]Tiwari R K,Trivedi M,Guang Z C,et al.Genetic transformation of Gentiana macrophylla with Agrobacterium rhizogenes: growth and production of secoiridoid glucoside gentiopicroside in transformed hairy root cultures[J].Plant Cell Rep,2007,26(2):199-210.

    [7]Zhang H L,Xue S H,Pu F,et al.Establishment of hairy root lines and analysis of gentiopicroside in the medicinal plant Gentiana macrophylla[J].Russ J Plant Physiol,2010,57:110-117.

    [8]齊香君,陳如意,王 薇.秦艽細胞懸浮培養(yǎng)研究I[J].中草藥,2010,41(3):472-475.

    [9]Ro D K,Paradise E M,Ouellet M,et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast[J].Nature,2006,440(7 086):940-943.

    [10]Ajikumar P K,Xiao W H,Tyo K E,et al.Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli[J].Science,2010,330(6 000):70-74.

    [11]Paddon C J,Westfall P J,Pitera D J,et al.High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin[J].Nature,2013,496(7 446):528-532.

    [12]Guo J,Zhou Y J,Hillwig M L,et al.CYP76AH1 catalyzes turnover of miltiradiene in tanshinones biosynthesis and enables heterologous production of ferruginol in yeasts[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(29):12 108-12 113.

    [13]Feng H,Yua Z,Chu P K.Ion implantation of organisms[J].Mat Sci Eng R,2006,54(3-4):49-120.

    [14]Lu J,Jin X,Mao P H,et al.Transfer of Ephedra genomic DNA to yeasts by ion implantation[J].Appl Biochem Biotechnol,2009,158(3):571-581.

    [15]黃國偉,毛培宏,金 湘,等.低能離子注入介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)化的原理與應(yīng)用[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2009,28(4):815-820.

    猜你喜歡
    離子注入秦艽龍膽
    龍膽瀉肝湯輔助治療濕熱瘀滯型慢性前列腺炎的療效觀察
    基于全球離子注入機行業(yè)現(xiàn)狀探析中國離子注入機突破之路
    秦艽不同配伍的抗炎鎮(zhèn)痛作用分析
    離子注入常見問題分析與研究
    尖葉假龍膽化學(xué)成分的研究
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:43
    不同廠家龍膽瀉肝丸中龍膽苦苷、梔子苷、黃芩苷的溶出度測定和比較
    中成藥(2016年4期)2016-05-17 06:07:40
    自擬吉杰吶博“粗莖秦艽”散外敷治療類風濕性關(guān)節(jié)炎腫痛40例
    四種龍膽的顯微結(jié)構(gòu)特征比較
    TLC法測定骨刺消痛膠囊中白芷、秦艽
    中藥秦艽治療風濕痹癥的綜述
    精华霜和精华液先用哪个| 免费在线观看成人毛片| 床上黄色一级片| 五月玫瑰六月丁香| 精品国产三级普通话版| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产午夜精品论理片| 中文资源天堂在线| 波野结衣二区三区在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 最近最新免费中文字幕在线| 日韩有码中文字幕| 日日夜夜操网爽| 国产精品国产高清国产av| 日韩精品青青久久久久久| 97超视频在线观看视频| 国产成人影院久久av| 99久国产av精品| 成人一区二区视频在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品久久久久久精品电影| 国产伦人伦偷精品视频| 一级av片app| 赤兔流量卡办理| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲欧美日韩无卡精品| or卡值多少钱| 欧美色欧美亚洲另类二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 少妇高潮的动态图| 3wmmmm亚洲av在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 午夜福利成人在线免费观看| 日本熟妇午夜| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美黄色淫秽网站| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲片人在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 人妻久久中文字幕网| 欧美乱色亚洲激情| 少妇丰满av| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美zozozo另类| 免费看日本二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲18禁久久av| 久久九九热精品免费| 国产 一区 欧美 日韩| 日本成人三级电影网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产麻豆成人av免费视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 天堂动漫精品| 亚洲人成电影免费在线| 9191精品国产免费久久| 村上凉子中文字幕在线| 免费搜索国产男女视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美区成人在线视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲五月天丁香| 国产久久久一区二区三区| 少妇高潮的动态图| 在线免费观看的www视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久伊人香网站| 成年版毛片免费区| 久久中文看片网| 久久性视频一级片| 午夜视频国产福利| 深夜a级毛片| 精品免费久久久久久久清纯| 高清在线国产一区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 免费高清视频大片| 国产日本99.免费观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 午夜福利18| 国产黄色小视频在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产午夜精品论理片| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲成a人片在线一区二区| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美又色又爽又黄视频| 天天躁日日操中文字幕| 怎么达到女性高潮| 国产真实伦视频高清在线观看 | 色av中文字幕| 757午夜福利合集在线观看| eeuss影院久久| 久久6这里有精品| 日本三级黄在线观看| 麻豆成人av在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 真人一进一出gif抽搐免费| 免费在线观看日本一区| 国产三级在线视频| 亚洲av熟女| 国产久久久一区二区三区| 九九在线视频观看精品| 亚洲无线在线观看| 性欧美人与动物交配| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久久国产成人免费| 午夜视频国产福利| 一级a爱片免费观看的视频| 成人午夜高清在线视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 我的老师免费观看完整版| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 如何舔出高潮| 日韩中文字幕欧美一区二区| 舔av片在线| 中出人妻视频一区二区| 国产成人aa在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产av在哪里看| 一个人免费在线观看电影| 精品久久久久久成人av| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜福利免费观看在线| 三级毛片av免费| 国产午夜精品论理片| 精品久久久久久久久亚洲 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 小说图片视频综合网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 在线观看舔阴道视频| 久久人人精品亚洲av| 欧美激情在线99| 国产在视频线在精品| 日本黄大片高清| 亚洲国产欧美人成| 国产久久久一区二区三区| 国产极品精品免费视频能看的| 久久精品影院6| 在线看三级毛片| 亚洲国产精品合色在线| 天堂√8在线中文| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲最大成人中文| 国产欧美日韩一区二区三| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 一进一出好大好爽视频| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 少妇的逼好多水| 国产日本99.免费观看| 国产毛片a区久久久久| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲午夜理论影院| 亚洲av.av天堂| 好男人在线观看高清免费视频| 在线国产一区二区在线| 我的女老师完整版在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 在线观看66精品国产| 长腿黑丝高跟| 精品久久久久久成人av| 国产精品影院久久| 性色avwww在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日本与韩国留学比较| 日本 欧美在线| 脱女人内裤的视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 免费在线观看亚洲国产| 一区二区三区激情视频| 午夜亚洲福利在线播放| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜福利18| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 床上黄色一级片| 国产精品久久久久久久久免 | а√天堂www在线а√下载| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲 国产 在线| а√天堂www在线а√下载| 真实男女啪啪啪动态图| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 精品久久久久久久末码| 91九色精品人成在线观看| 精品国产三级普通话版| 久久久久性生活片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久久久久九九精品二区国产| 精品免费久久久久久久清纯| 丁香六月欧美| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久9热在线精品视频| 亚洲,欧美,日韩| 宅男免费午夜| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 久久精品综合一区二区三区| av黄色大香蕉| 美女大奶头视频| 久久九九热精品免费| 欧美乱色亚洲激情| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产精品影院久久| 十八禁人妻一区二区| 18+在线观看网站| 婷婷六月久久综合丁香| 很黄的视频免费| 一级黄色大片毛片| av视频在线观看入口| 99热精品在线国产| 色吧在线观看| 校园春色视频在线观看| 国产精品影院久久| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲专区国产一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 最近在线观看免费完整版| 天天一区二区日本电影三级| 一个人免费在线观看的高清视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一级a爱片免费观看的视频| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩人妻高清精品专区| 午夜福利视频1000在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 天美传媒精品一区二区| 免费av观看视频| 高清日韩中文字幕在线| 午夜福利成人在线免费观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 99热这里只有精品一区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲成人久久爱视频| 网址你懂的国产日韩在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 免费在线观看成人毛片| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲欧美日韩无卡精品| 两个人视频免费观看高清| 色av中文字幕| 国产亚洲精品久久久久久毛片| www.色视频.com| 嫁个100分男人电影在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 757午夜福利合集在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美日韩乱码在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 成人国产综合亚洲| 久久亚洲精品不卡| 亚洲成av人片免费观看| 人人妻人人看人人澡| 午夜影院日韩av| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲不卡免费看| 国产不卡一卡二| 性色av乱码一区二区三区2| 99久国产av精品| 成人国产综合亚洲| 精品国产三级普通话版| 欧美成人a在线观看| 午夜久久久久精精品| 在线a可以看的网站| 国产91精品成人一区二区三区| 性插视频无遮挡在线免费观看| 午夜福利成人在线免费观看| 国产老妇女一区| 免费电影在线观看免费观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 看片在线看免费视频| 久久中文看片网| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看 | 直男gayav资源| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产精品三级大全| 成人一区二区视频在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 成人永久免费在线观看视频| 国产三级黄色录像| 99精品在免费线老司机午夜| 日本精品一区二区三区蜜桃| 99热这里只有是精品50| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产野战对白在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 在线观看66精品国产| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产免费av片在线观看野外av| 99久国产av精品| 日本五十路高清| 精品免费久久久久久久清纯| 国内精品久久久久精免费| 国产伦精品一区二区三区视频9| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 色综合婷婷激情| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 又爽又黄a免费视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看| 51国产日韩欧美| 不卡一级毛片| 国产欧美日韩一区二区精品| 12—13女人毛片做爰片一| 一本久久中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美激情在线99| 搞女人的毛片| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美日本视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 动漫黄色视频在线观看| 好男人电影高清在线观看| av专区在线播放| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品欧美国产一区二区三| 免费看光身美女| 天堂动漫精品| 91麻豆av在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 中文在线观看免费www的网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 一级作爱视频免费观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| a级毛片免费高清观看在线播放| 超碰av人人做人人爽久久| 日韩欧美在线二视频| 国内精品美女久久久久久| 亚洲av成人av| 两人在一起打扑克的视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久久国产成人免费| 午夜福利视频1000在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日本免费a在线| 看黄色毛片网站| 久久久久久久午夜电影| 午夜视频国产福利| 舔av片在线| 欧美高清成人免费视频www| 午夜福利免费观看在线| 中文资源天堂在线| 日本免费a在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产精品精品国产色婷婷| 国产精品不卡视频一区二区 | 成人精品一区二区免费| 90打野战视频偷拍视频| 免费av观看视频| 亚洲最大成人av| 人人妻人人看人人澡| 久久久久久大精品| 在线播放无遮挡| 嫩草影院精品99| 在线观看舔阴道视频| av在线天堂中文字幕| 亚洲午夜理论影院| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲国产精品合色在线| 精品久久久久久久末码| 日本黄色视频三级网站网址| 麻豆成人午夜福利视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 熟女人妻精品中文字幕| av在线观看视频网站免费| 天天一区二区日本电影三级| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产高清有码在线观看视频| 免费观看精品视频网站| 日韩免费av在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 国产成人啪精品午夜网站| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美在线一区亚洲| 欧美最黄视频在线播放免费| av天堂在线播放| 久久久久九九精品影院| 一本综合久久免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲精品色激情综合| 国产单亲对白刺激| 午夜福利欧美成人| 中文在线观看免费www的网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费人成在线观看视频色| 国产一区二区激情短视频| 看片在线看免费视频| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲国产精品合色在线| 最后的刺客免费高清国语| 动漫黄色视频在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| av天堂在线播放| 国产精品伦人一区二区| av欧美777| 级片在线观看| 99热只有精品国产| 内地一区二区视频在线| 波多野结衣高清无吗| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产精品人妻久久久久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| av福利片在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 午夜福利18| 国产成人aa在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 成人无遮挡网站| 成人一区二区视频在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 九色成人免费人妻av| aaaaa片日本免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 少妇的逼好多水| 亚洲欧美激情综合另类| 中文字幕高清在线视频| 国产一区二区在线观看日韩| 桃红色精品国产亚洲av| 日韩欧美在线乱码| 国产高清激情床上av| 久99久视频精品免费| 国产午夜精品论理片| 国产精品,欧美在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 日本黄大片高清| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 夜夜夜夜夜久久久久| 黄色一级大片看看| 日韩中字成人| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲在线观看片| 成年女人看的毛片在线观看| 99热只有精品国产| 两个人视频免费观看高清| 亚洲在线自拍视频| av中文乱码字幕在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 麻豆久久精品国产亚洲av| 男女之事视频高清在线观看| 午夜久久久久精精品| 不卡一级毛片| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 真实男女啪啪啪动态图| 久久人人精品亚洲av| 青草久久国产| 国产午夜精品论理片| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲专区国产一区二区| 久久久久久久午夜电影| 国产精品亚洲美女久久久| 免费搜索国产男女视频| 国产极品精品免费视频能看的| 国产麻豆成人av免费视频| 无遮挡黄片免费观看| 日本三级黄在线观看| 精品午夜福利在线看| 9191精品国产免费久久| 老鸭窝网址在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产色爽女视频免费观看| 成年女人永久免费观看视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 99riav亚洲国产免费| 久久热精品热| 欧美成人免费av一区二区三区| 我的女老师完整版在线观看| 看黄色毛片网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲一区二区三区色噜噜| 两人在一起打扑克的视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 免费观看精品视频网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 成年女人看的毛片在线观看| 色视频www国产| 亚洲自拍偷在线| 精品久久久久久久久久久久久| 久久精品影院6| 内射极品少妇av片p| 国产成人影院久久av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品伦人一区二区| 亚洲av免费在线观看| 中文资源天堂在线| 99riav亚洲国产免费| 国产精品影院久久| 在线播放国产精品三级| 亚洲国产欧美人成| 成年版毛片免费区| 熟女人妻精品中文字幕| 男女下面进入的视频免费午夜| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品精品国产色婷婷| 在线观看66精品国产| 热99re8久久精品国产| 国产主播在线观看一区二区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 日韩av在线大香蕉| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美乱妇无乱码| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 一级黄片播放器| 久久99热这里只有精品18| 成人精品一区二区免费| 精品久久久久久久末码| 99国产极品粉嫩在线观看| 又爽又黄a免费视频| or卡值多少钱| 午夜两性在线视频| 国产亚洲欧美98| 97超视频在线观看视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 男人舔奶头视频| 日本三级黄在线观看| 九九热线精品视视频播放| 波野结衣二区三区在线| 免费在线观看成人毛片| 亚洲激情在线av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产精华一区二区三区| 精品人妻视频免费看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日本五十路高清| 最近最新中文字幕大全电影3| 一级毛片久久久久久久久女| 国产一区二区三区视频了| 成年女人毛片免费观看观看9| 长腿黑丝高跟| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 中文字幕av在线有码专区| 成人无遮挡网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲av成人精品一区久久| 最近中文字幕高清免费大全6 | 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲在线自拍视频| av视频在线观看入口| 大型黄色视频在线免费观看| av黄色大香蕉| 午夜亚洲福利在线播放| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 一区二区三区激情视频| 如何舔出高潮| 成人特级av手机在线观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久99热6这里只有精品| 天堂动漫精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产免费男女视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 中文资源天堂在线| 男女之事视频高清在线观看| 黄色配什么色好看| 欧美激情在线99| 亚洲经典国产精华液单 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 天天一区二区日本电影三级| 欧美激情在线99| 黄色日韩在线| 中国美女看黄片|