添加不同碳氮源對蛹蟲草子實(shí)體生長的影響

秦俊哲， 殷 紅， 任金玫

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)又稱北冬蟲夏草，屬真菌門((Eumy cota )，麥角菌科(Claviciptiaceae)，蟲草屬(Cordyceps)[1].其主要藥用成分為蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖和SOD等，具有與天然冬蟲夏草相似的藥用和滋補(bǔ)功效，有些重要活性成分還明顯高于冬蟲夏草[2].它可以作為冬蟲夏草的理想替代品[3].

蛹蟲草子實(shí)體是其主要功效成分載體，近年來蛹蟲草人工栽培技術(shù)獲得一定程度的發(fā)展，在麥粒、大米、玉米渣、麩皮等為培養(yǎng)基上生長的蛹蟲草都有所報(bào)道[4-8].麥粒作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)用廣泛而且廉價(jià)，是栽培蛹蟲草的理想原料.但以麥粒作為主料還需補(bǔ)充哪些輔助的營養(yǎng)物質(zhì)還尚未定論，本文以CM2為實(shí)驗(yàn)菌株，麥粒為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究添加不同營養(yǎng)物質(zhì)對菌絲及子實(shí)體生長的影響，為篩選適合蛹蟲草生長的培養(yǎng)基提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：蛹蟲草CM2為陜西科技大學(xué)微生物研究室提供.

1.2 實(shí)驗(yàn)配方

①固體斜面培養(yǎng)基： PDA加富培養(yǎng)基；②液體培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，VB12片，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，水1 000 mL，自然pH；③固體栽培培養(yǎng)基：小麥粒30 g，蠶蛹粉2 g，營養(yǎng)液：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，VB120 mg，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，水1 000 mL，自然pH，料液比為1∶1.5.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)斜面菌種擴(kuò)培

將活化好的蛹蟲草菌種分別接入固體斜面培養(yǎng)基，以葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇為碳源，編號為1、2、3、4、5，無碳源的記為6，以蛋白胨、酵母粉、黃豆粉、氯化銨、硫酸銨為氮源編號為7、8、9、10、11，無氮源的記為12，每個(gè)處理做5個(gè)平行，常規(guī)滅菌，冷卻后在無菌室內(nèi)將供試菌種分別接入斜面培養(yǎng)基，在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗室培養(yǎng)7 d,觀察菌絲形態(tài)，測定菌絲生長速度.

(2)液體菌種制作

取斜面約0.5 cm2的三塊菌種接入裝有100 mL高壓滅菌冷卻后的液體培養(yǎng)基中，在22 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d.

表1 菌絲在不同碳源斜面上的菌絲長勢

注：+++代表菌絲健壯，致密；++代表菌絲較健壯，較致密；+代表菌絲瘦弱，纖細(xì)，稀疏.

(3)實(shí)驗(yàn)配方設(shè)計(jì)

以固體栽培培養(yǎng)基為對照，分別添加葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇為碳源，編號為1、2、3、4、5，無碳源的記為6，添加蛋白胨、酵母粉、黃豆粉、氯化銨、硫酸銨為氮源，編號為7、8、9、10、11，無氮源的記為12，分別加入500 mL罐頭瓶中，在0.1 Mpa壓力下121 ℃滅菌90 min，冷卻后，接入液體菌種，22 ℃下培養(yǎng)觀察菌絲生長狀況，測量子實(shí)體干重，并記錄.

(4)蟲草菌素含量的測定[9]

樣品制備：稱取樣品0.300 g，加蒸餾水20 mL，超聲波提取20 min，過濾，濾液用50%乙醇定容至100 mL，在紫外分光光度計(jì)259 nm下檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳源對斜面菌絲生長的影響

將活化好的蛹蟲草菌種分別接入不同的碳源培養(yǎng)基上，菌絲生長速度和長勢結(jié)果如圖1和表1所示.從圖1和表1可以看出蛹蟲草CM2在5種碳源的培養(yǎng)基上均能生長，但菌絲體生長速度不同.在葡萄糖和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上，菌絲的平均生長速度分別可達(dá)到3.47 cm/d和3.44 cm/d，且菌絲健壯濃密，潔白有光澤.以甘露醇和可溶性淀粉為碳源的次之，乳糖和對照組的菌絲長速最慢，長勢最差.因此，確定葡萄糖和蔗糖為菌絲生長的較適碳源.

圖1 菌絲在不同碳源斜面上的生長速度

2.2 不同氮源對斜面菌絲生長的影響

將活化好的蛹蟲草菌種分別接入不同的氮源培養(yǎng)基上，菌絲生長速度和長勢結(jié)果如圖2和表2所示.從圖2和表2可以看出蛹蟲草CM2不僅可以利用有機(jī)氮源，還可以利用無機(jī)氮源，相比之下，有機(jī)氮源更有利于菌絲的生長.在以蛋白胨和黃豆粉為氮源時(shí)，菌絲的平均生長速度可分別達(dá)到3.26 cm/d和3.07 cm/d，菌絲生長健壯，致密，潔白有光澤.以硫酸銨、氯化銨、酵母粉為氮源時(shí)，菌絲生長相對緩慢，但酵母粉優(yōu)于硫酸銨和氯化銨.綜合比較可得，蛋白胨為較適的氮源.

圖2 菌絲在不同氮源斜面上的生長速度

培養(yǎng)氮源7蛋白凍8酵母粉9黃豆粉10氯化銨11硫酸銨12CK菌絲長勢+++++++++++

2.3 不同碳源對固體栽培蛹蟲草子實(shí)體的影響

圖3 不同碳源對子實(shí)體產(chǎn)量及蟲草素的影響

(a) 葡萄糖 (b) 乳糖

(c) 淀粉 (d) 蔗糖

(e) 甘露醇 (f) CK圖4 添加不同碳源對子實(shí)體形態(tài)的影響

將液體菌種分別接入不同的碳源固體栽培培養(yǎng)基上，子實(shí)體的干重、蟲草素含量和形態(tài)變化情況如圖3和圖4所示.從圖3可以看出，可溶性淀粉和蔗糖是合適的碳源，子實(shí)體密集，粗壯，以100 g培養(yǎng)料為基礎(chǔ)子實(shí)體的產(chǎn)量分別為51.3 g和57 g.蟲草素含量分別為13.87 mg/g和15.76 mg/g，其次是葡萄糖、甘露醇、乳糖，說明同一種碳源對蛹蟲草菌絲體生長、子實(shí)體分化發(fā)育的影響是不同的，有利于菌絲的生長，不一定能得到最大的子實(shí)體產(chǎn)量.甘露醇在試驗(yàn)中對比最明顯.

這是由于菌絲生長的培養(yǎng)基內(nèi)只添加了單一的碳源，而栽培子實(shí)體的固體小麥培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)還含有營養(yǎng)成分，麥粒中淀粉含量高而蛋白質(zhì)含量低屬難吸收大分子.故在麥?；|(zhì)中添加可溶性易吸收的小分子糖，子實(shí)體在生長中可以更好地吸收利用.與葡萄糖相比，蔗糖促進(jìn)代謝的效果更好，而乳糖和甘露醇對促進(jìn)菌絲生長沒有明顯作用.結(jié)合生產(chǎn)需要，選用單一的麥?；|(zhì)不利于子實(shí)體生長，應(yīng)該在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中選擇添加蔗糖或者可溶性淀粉等碳源，以獲得產(chǎn)量更高的子實(shí)體.

2.4 不同氮源對固體栽培蛹蟲草的影響

將液體菌種分別接入不同的氮源固體栽培培養(yǎng)基上，子實(shí)體的干重、蟲草素含量和形態(tài)變化情況如圖5和圖6所示.

圖5 不同氮源對子實(shí)體產(chǎn)量及蟲草素的影響

(a) 蛋白胨 (b) 酵母粉

(c) 黃豆粉 (d) 氯化銨

(e) 硫酸銨 (f) CK圖6 添加不同氮源對子實(shí)體形態(tài)的影響

由圖5可以看出，有機(jī)氮源對促進(jìn)子實(shí)體的生長作用明顯優(yōu)于無機(jī)氮源，培養(yǎng)到第5 d時(shí)，菌絲已經(jīng)長滿罐頭瓶表面，且健壯濃密.從子實(shí)體的產(chǎn)量和蟲草素含量可以看出，有利于菌絲生長的有機(jī)氮源同樣有利于子實(shí)體發(fā)育.以蛋白胨、酵母粉、黃豆粉為氮源時(shí)子實(shí)體在每100 g培養(yǎng)料中的產(chǎn)量分別可達(dá)55.67 g、47 g和54.67 g.蟲草素含量分別為14.32 mg/g，12.73 mg/g，14.26 mg/g，并且以蛋白胨為氮源時(shí)子實(shí)體粗壯，色澤橙紅，質(zhì)量高，酵母粉和黃豆粉子實(shí)體長勢次之.

有機(jī)氮源中所含的有蛋白質(zhì)、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)更利于真菌生長，而麥粒培養(yǎng)基質(zhì)中也含有少量氮源，可以短暫補(bǔ)充微生物所需的營養(yǎng).菌體在利用碳源的同時(shí)也需要一定的氮源來維持正常生命代謝活動(dòng).蛋白胨是蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，富含有機(jī)氮化合物以及糖類和維生素，是最易吸收的氨基態(tài)氮可以促進(jìn)子實(shí)體生長，因此是理想的氮源；酵母粉與黃豆粉都屬于有機(jī)氮，但黃豆粉為機(jī)體直接吸收利用但營養(yǎng)物質(zhì)不及蛋白胨；無機(jī)氮氯化銨和硫酸銨其成分單一，可以被快速利用，在子實(shí)體生長中消耗較快，不能滿足菌體需求.結(jié)合產(chǎn)量和質(zhì)量考慮，蛋白胨為最適氮源.

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適合蛹蟲草CM2菌絲生長的培養(yǎng)基組成為馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，VB120 mg，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，水1 000 mL，自然pH.適合子實(shí)體生長的培養(yǎng)基組成為麥粒30 g，蠶蛹粉2 g，營養(yǎng)液：馬鈴薯(去皮)200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，VB120 mg，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，水1 000 mL，自然pH，料液比為1∶1.5. 此結(jié)論與陳磊[10]得到蛹蟲草菌絲在培養(yǎng)時(shí)最適的碳源、氮源不同.與秦秀麗[11]等人對固體栽培培養(yǎng)基優(yōu)化類似.不同碳氮源對蛹蟲草菌絲生長和子實(shí)體產(chǎn)量均有一定的影響，不同的蛹蟲草菌可能由于菌種差異而選擇不同的碳氮源.以麥粒為基質(zhì)，碳氮比達(dá)不到生長要求，所以為彌補(bǔ)菌體的生長添加不同的碳氮源，從而促進(jìn)子實(shí)體生長.對于不同的蛹蟲草生長所需要的營養(yǎng)及生長條件還需要進(jìn)一步研究.

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