嬰幼兒配方乳粉中非目標(biāo)性致病菌的分離與系統(tǒng)鑒定*

李 妍，王孝研，胡友波

（黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江 哈爾濱 150050）

嬰幼兒配方乳粉的生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜，殺菌、濃縮工序、包裝等過程中都容易出現(xiàn)質(zhì)量問題。殺菌不徹底造成菌落總數(shù)過高[1]，導(dǎo)致最終產(chǎn)品微生物超標(biāo)[2]；設(shè)備清洗不徹底、設(shè)備故障等，均容易導(dǎo)致產(chǎn)品大腸菌群和雜質(zhì)超標(biāo)[3]。并且嬰幼兒配方奶粉中營養(yǎng)成分豐富，極其利于微生物的生長繁殖。一旦出現(xiàn)上述質(zhì)量問題，將對嬰幼兒的生長發(fā)育及身心健康造成不利影響。而大多數(shù)情況下，安全監(jiān)管者在嬰幼兒配方乳粉的生物安全監(jiān)測方面處于相對被動的局面。通過系統(tǒng)地對嬰幼兒配方乳粉中的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，菌種分離，菌種鑒定，再對菌種鑒定結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計，可全面了解嬰幼兒配方乳粉中的菌落分布與構(gòu)成，對嬰幼兒配方乳粉的質(zhì)量監(jiān)督與監(jiān)測和企業(yè)的自行監(jiān)督具有指導(dǎo)意義，并為檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供有力的參考，更為改變監(jiān)管的被動局面提供充分的理論依據(jù)[4]。

對嬰幼兒配方乳粉中微生物分離與鑒定方面的研究，在國內(nèi)、外很少有相關(guān)報道。目前，除了國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的微生物檢驗方法外，在1994年，我國僅有關(guān)于“奶粉細(xì)菌污染情況”的相關(guān)報道，但僅限定在菌落總數(shù)、大腸菌群、腸球菌和蠟樣芽孢桿菌五種微生物指標(biāo)范圍內(nèi)，并沒有對樣品中的微生物進(jìn)行全面的篩查。而且，經(jīng)過十多年的發(fā)展，嬰幼兒配方乳粉在生產(chǎn)工藝和其他方面上發(fā)生很大改變，其研究結(jié)果早已不適用于今日?？梢姡趮胗變号浞饺榉壑形⑸镂廴厩闆r的調(diào)查及研究方面，目前尚存在空缺。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

選取黑龍江省市售的不同品牌、不同批次、不同段數(shù)的嬰幼兒配方乳粉400個批次進(jìn)行篩查。

1.2 實驗試劑

BPW緩沖蛋白胨水、mLST改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯、萬古霉素、阪崎顯色培養(yǎng)基、TTB四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎(chǔ)、碘液、煌綠、SC亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、BS亞硫酸鉍瓊脂、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、Baird-Parker培養(yǎng)基基礎(chǔ)、亞碲酸鉀卵黃增菌液、血瓊脂基礎(chǔ)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，以上培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；新鮮兔血漿（哈爾濱市疾控中心）；

3M金黃色葡萄球菌測定紙片（美國3M公司）。

1.3 實驗設(shè)備

VITEK 2 compactsystem全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（以下簡稱“VITEK 2 compact”）（美國BIOMERIEUX.inc）；BSC-1000-Ⅱ-A2BSC生物安全柜（北京世安科林凈化技術(shù)有限公司）；CJ-S-I層流潔凈工作臺（上海博泰實驗設(shè)備有限公司）；BagMixer400W拍擊式均質(zhì)器（法國interscience）；MLS-3780高壓蒸汽滅菌器（日本三洋）；101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；HZQ-FX全溫振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；DH-6000BⅡ（3臺）電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DW-HL100低溫冷凍儲存箱（中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司）。

1.4 實驗步驟

1.4.1 樣品的處理 取25g嬰幼兒配方乳粉（嬰兒配方乳粉、較大嬰兒和幼兒配方乳粉），分別加入225mLBPW中，使用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2min，于36℃培養(yǎng)8～18h。移取1mL前增菌液，轉(zhuǎn)種于10mLTTB，于42℃培養(yǎng)24h；同時，另取1mL增菌液，轉(zhuǎn)種于10mLSC中，于36℃培養(yǎng)24h。分別取1環(huán)增菌液，劃線于BS和沙門顯色培養(yǎng)基上，于36℃培養(yǎng)48h和24h[5]。

另稱取25g樣品加入225mL滅菌生理鹽水中，使用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2min。分別取10-1g、10-2g、10-3g各1mL涂布到3個Baird-Parker上，每個平板分別涂布0.3、0.3和0.4mL。同時接種1mL于3M金黃色葡萄球菌測定紙片，于36℃培養(yǎng)48h[6]。

另稱取100g樣品加入900mLBPW中，使用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2min，于36℃培養(yǎng)18h。移取1mL前增菌液，轉(zhuǎn)種于10mLmLST-Vm，于44℃培養(yǎng)24h。取1環(huán)增菌液，劃線于阪崎顯色培養(yǎng)基上，于36℃培養(yǎng)24h。挑去可疑菌落接種于TSI，25℃培養(yǎng)48h[7]。

1.4.2 目標(biāo)菌的選擇 篩選出在選擇培養(yǎng)基或試紙片上有陽性反應(yīng)的菌落，作為可疑菌落，作進(jìn)一步生化分析。

表1 目標(biāo)菌株的陽性選擇Tab.1 Positive selection of target strains

1.4.3 生化鑒定 將可疑菌落三區(qū)劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，36℃培養(yǎng)20～24h，進(jìn)行純化。

純化后的可疑菌落轉(zhuǎn)種于營養(yǎng)肉湯中，36℃振蕩培養(yǎng)24h，以保存和后期使用。

使用VITEK 2 compact對純化后的可疑菌落進(jìn)行生化鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 可疑菌落的鑒定結(jié)果

表2中為本次試驗生化鑒定出的可疑菌株及其獲得途徑。

由表2中可以看出，在400個嬰幼兒配方乳粉的5200個項目中，29個項目共通過18個途徑鑒定出15種非目標(biāo)性致病菌。另外，通過兩種不同沙門氏菌檢測途徑鑒定出2個阪崎腸桿菌。

在鑒定出的非目標(biāo)性致病菌中，檢測金黃色葡萄球菌的途徑鑒定出3株；檢測阪崎腸桿菌的途徑鑒定出11株；檢測沙門氏菌的途徑鑒定出17株?？梢姡b定中沙門氏菌途徑檢測出的非目標(biāo)性致病菌最多。分析其原因，沙門氏菌共有2000多個血清型，換而言之，就是沙門氏菌的均屬最多，選擇性增菌液及選擇性培養(yǎng)基的為了不漏查，往往選擇性較差，因此出現(xiàn)假陽性的幾率顯著增加。

表2 生化鑒定菌株Tab.2 Strains of biochemical identification

2.2 結(jié)果與討論

2.2.1 實驗條件的選擇

（1）增菌液的選擇 試驗中增菌液的選擇很重要，要選擇增菌效果好且合適的增菌液，如若不然會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。為檢測工作帶來不必要的麻煩。在本實驗中，選擇了GB4789.4-2010、GB4789.10-2010和GB4789.40-2010標(biāo)準(zhǔn)中要求的前增菌液和選擇性增菌液。所能鑒定的菌株可以從一定層面上證明檢測該非目標(biāo)性致病菌可以選用該途徑的增菌液。為相關(guān)部門制定檢測方法提供了一定依據(jù)。

（2）選擇性培養(yǎng)基的選擇 試驗中選擇性培養(yǎng)基的選擇同樣重要，試驗中要選擇對目標(biāo)菌有選擇專一性且目標(biāo)菌在上面長勢良好的培養(yǎng)基，如若不然，檢測工作會更加繁瑣。在本實驗中，選擇了GB4789.4-2010、GB4789.10-2010和GB4789.40-2010標(biāo)準(zhǔn)中要求的選擇性培養(yǎng)基。所能鑒定的菌株可以從一定層面上證明檢測該非目標(biāo)性致病菌可以選用該途徑的選擇性培養(yǎng)基。為相關(guān)部門制定檢測方法提供了一定依據(jù)。

（3）培養(yǎng)分離 在目標(biāo)菌培養(yǎng)分離過程中，一定會有非目標(biāo)菌種的存在，注意要將每一種近似目標(biāo)菌形態(tài)的菌落進(jìn)行培養(yǎng)分離，然后生化鑒定，最后比對與目標(biāo)菌的區(qū)別。這樣將會為嬰幼兒配方奶粉在生產(chǎn)工藝的改進(jìn)與微生物污染的控制方面提供依據(jù)。

2.2.2 生化鑒定出的非目標(biāo)性致病菌產(chǎn)生的必然性和可能性分析 嬰幼兒配方乳粉在生產(chǎn)或包裝過程中，有環(huán)境或滅菌不完全會引入一些致病菌，而致病菌的種類不僅僅局限于國家標(biāo)準(zhǔn)上要求的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和阪崎腸桿菌3種，而另有15種致病菌作為潛在的危機(jī)，仍然沒有受到重視。以濕法生產(chǎn)嬰幼兒配方乳粉為例，從生產(chǎn)工藝、原料乳等方面分析生化鑒定出的非目標(biāo)致病菌產(chǎn)生的必然性和可能性。

（1）原料乳驗收時需依據(jù)GB 19301對原料乳進(jìn)行檢驗。原料乳在運(yùn)輸過程中會因為儲存條件不當(dāng)而引起菌落總數(shù)超標(biāo)。有些致病菌在此過程中被引入到原料乳中，如果后期生產(chǎn)時沒有得到有效的處理，就會使成品嬰幼兒配方乳粉中仍然存在檢出致病菌的風(fēng)險。

（2）凈乳過程中，儲存在奶缸內(nèi)的生奶經(jīng)奶泵打入離心式凈乳機(jī)進(jìn)行凈乳，去除部分細(xì)菌和雜質(zhì)。如果凈乳過程除菌不完全，也會存在成品嬰幼兒配方乳粉中檢出致病菌的風(fēng)險。

（3）冷藏前的殺菌為巴氏殺菌。殺菌設(shè)備對均質(zhì)后的原料乳殺菌，濃縮前的殺菌依據(jù)不同產(chǎn)品的工藝要求選擇合適的殺菌方法。如果滅菌溫度、時間不能達(dá)到要求就有可能造成殺菌不完全而引起成品嬰幼兒配方乳粉中被檢出致病菌。

（4）篩粉、晾粉或經(jīng)過流化床過程，目的是為了降溫和讓噴霧干燥后的乳粉流動性更好。要控制好灌裝車間的溫度、濕度及微生物指標(biāo)和各種接觸器皿的無菌清潔。要求灌裝車間應(yīng)達(dá)到一定的潔凈度等級，以滿足此生產(chǎn)過程的環(huán)境要求。如果灌裝車間不能達(dá)到要求的潔凈度等級，就會造成暴露在環(huán)境中的半成品被污染而引發(fā)成品被檢出致病菌的可能。

（5）包裝過程對包裝車間的空氣潔凈度等級有一定的要求。如果灌裝車間不能達(dá)到要求的潔凈度等級，就會造成暴露在環(huán)境中的半成品被污染而引發(fā)成品被檢出致病菌的可能。

（6）CIP清洗過程要在每一次生產(chǎn)前、后都要對與物料接觸的所有設(shè)備、管道進(jìn)行清洗，以保證設(shè)備、管道足夠潔凈而不會造成半成品污染。如果CIP清洗不完全或次數(shù)不足就會引起半成品在設(shè)備、管道受到污染，而引發(fā)成品被檢出致病菌的可能。

2.2.3 全自動生化分析系統(tǒng)的優(yōu)勢與不足

（1）與傳統(tǒng)方法相比較，利用全自動生化分析系統(tǒng)鑒定待測菌株具有節(jié)約時間、鑒定廣泛等特點。

（2）但全自動生化分析系統(tǒng)還具有一定的局限性：只能鑒定庫中存在的菌株，其他菌株還有待繼續(xù)升級；選取樣品量要求3～4個菌落，如果純化不完全會造成混雜而鑒定不出來或置信度極低，而造成漏檢。因此，要求儀器操作人員具有一定預(yù)判能力，以防影響檢測結(jié)果。

（3）本文只對非目標(biāo)性致病菌進(jìn)行分離鑒定，還需要進(jìn)一步的了解和分析，有待以后工作中繼續(xù)進(jìn)行此方向的研究。

由實驗結(jié)果可以看出，通過沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌3種致病菌的前增菌、增菌和分離培養(yǎng)，分離出一系列的疑似目標(biāo)菌但并非目標(biāo)菌的菌落。利用全自動生化分析系統(tǒng)的鑒定純化后菌落，發(fā)現(xiàn)共有肺炎克雷伯菌、鮑曼復(fù)合群不動桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌群、弗勞地檸檬酸桿菌、解鳥氨酸拉烏爾菌、陰溝腸桿菌、泛菌屬、非脫羧勒克菌、淺黃假單胞菌、大腸埃希氏菌、液化沙雷菌、聚團(tuán)泛菌、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌、人葡萄球菌（人亞種）、克氏庫克菌15種非目標(biāo)致病菌。經(jīng)生化鑒定，鑒定置信度都在可接受范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

以黑龍江市售的400個嬰幼兒配方乳粉作為研究對象，分離并鑒定出有沙門氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌試驗中定為可疑菌株但并非其3種致病菌的其他菌株，并利用全自動分析系統(tǒng)鑒定出嬰幼兒配方粉中非目標(biāo)性致病菌。

依據(jù) GB10765-2010[8]和 GB10767-2010[9]兩項嬰幼兒食品的國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的取樣原則，要求每個樣品做5組沙門氏菌、3組阪崎腸桿菌、5組金黃色葡萄球菌的檢測。由此可知，每個嬰幼兒配方乳粉樣品都要做3類13項致病菌的檢測。因此，400個樣品共計5200個項目中，共涉及27個樣品被鑒定出15種非目標(biāo)性致病菌。

由此可見，在嬰幼兒配方乳粉中仍然存在一定的食品安全隱患，這些非目標(biāo)性致病菌可能來自生產(chǎn)環(huán)節(jié)中每一個環(huán)節(jié)。這就要求嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)要加強(qiáng)對生產(chǎn)條件和生產(chǎn)環(huán)境的優(yōu)化和管理，以確保嬰幼兒配方乳粉不被環(huán)境中的致病污染而引起食源性疾病。

通過對這些菌株的生理生化研究將對嬰幼兒配方奶粉在生產(chǎn)工藝的改進(jìn)與微生物污染的控制方面有重要的意義。

[1] 菌落總數(shù)檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2010，（4）:42-44.

[2] 魏國美.國內(nèi)食品菌落總數(shù)測定方法研究[J].福建分析測試，2008,17（4）:32-35.

[3] 馬冬，等.PCR檢測乳品中大腸桿菌的研究[J].食品科學(xué)，2009,30（4）:260-263.

[4] 魏民,周敏,朱葉秋,等.鄉(xiāng)間布丘菌致敗血癥一例[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，1999,（2）:45-47.

[5] GB 4789.4-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗[S].中華人民共和國衛(wèi)生部.

[6] GB 4789.10-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗[S].中華人民共和國衛(wèi)生部.

[7] GB 4789.40-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗阪崎腸桿菌檢驗[S].中華人民共和國衛(wèi)生部.

[8] GB 10765-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品[S].中華人民共和國衛(wèi)生部.

[9] GB 10767-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒和幼兒配方食品[S].中華人民共和國衛(wèi)生部.