RP－HPLC 和麝香草酚法檢測硝酸鹽氮的比較

紀曉娜，劉 晶，左 妍，艾勝書，任志敏，邊德軍，＊

（1.長春工程學(xué)院理學(xué)院；2.長春工程學(xué)院水利與環(huán)境工程學(xué)院；3.吉林省城市污水處理重點實驗室，長春 130012）

RP－HPLC 和麝香草酚法檢測硝酸鹽氮的比較

紀曉娜1，3，劉 晶1，3，左 妍1，3，艾勝書2，3，任志敏2，3，邊德軍2，3，＊

（1.長春工程學(xué)院理學(xué)院；2.長春工程學(xué)院水利與環(huán)境工程學(xué)院；3.吉林省城市污水處理重點實驗室，長春 130012）

針對處理后的城市污水，分別進行了反相高效液相色譜法（RP－HPLC）和麝香草酚法的硝酸鹽氮檢測試驗，并結(jié)合檢測原理對比研究了2種方法的線性范圍、檢出限、平行偏差、方法偏差、檢測時間和試劑消耗等。結(jié)果表明：RP－HPLC的線性范圍在2.00～25.00mg·L－1之間，線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 93，檢出限為0.001mg·L－1，樣品的平行偏差在0.01%～0.33%之間，檢測時間為4min，使用了3種藥品；麝香草酚法樣品的平行偏差在0.83%～12%之間，檢測時間為6min，使用7種藥品；RP－HPLC相對于麝香草酚分光光度法的方法偏差在－6.3%～8.3%之間。

硝酸鹽氮；反相高效液相色譜法；麝香草酚分光光度法；城市污水

0 引言

城市污水包括生活污水、工業(yè)廢水和降水，城市污水具有總氮（TN）含量高的特點，在處理過程中，大部分轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的硝酸鹽氮。本實驗室在研究城市污水處理反應(yīng)器［1－2］的同時，研究了城市污水的硝酸鹽氮檢測方法，針對處理后的城市污水中硝酸鹽氮含量高的特點，引入反相高效液相色譜法（RP－HPLC），該方法被成功地應(yīng)用到了城市污水的檢測中，目前這項應(yīng)用還未見報道。在此基礎(chǔ)上，我們繼續(xù)做了RP－HPLC和麝香草酚分光光度法［3］檢測城市污水中硝酸鹽氮的方法比較。

檢測水中硝酸鹽氮的方法很多［4－6］，目前常用的有分光光度法（如酚二磺酸分光光度法［7］、麝香草酚法［3］和雙波長的紫外分光光度法［8］）、光譜法（如氣相分子吸收光譜法［9］）、色譜法（如離子色譜法［10］、反相高效液相色譜法［11］、離子對色譜法［12］和毛細管電泳法［13］）等。隨著檢測手段的進步，很多大型儀器逐漸普及，成為實驗室常用檢測手段，相對于傳統(tǒng)檢測方法更具高效性，有逐步取代分光光度法的趨勢。

但是傳統(tǒng)方法經(jīng)過多年的使用，有的已經(jīng)成為國家標(biāo)準(zhǔn)，有的得到了大家的普遍認可，因此使用儀器檢測結(jié)果的可靠性需要進一步確認，這方面的工作已經(jīng)得到人們的重視，如測定過氧化氫［14］和豬苓多糖［15］的方法比較研究，對于分光光度法與高效液相色譜法的方法比較也見到一些報道，如食品增味劑中麥芽酚［16］、胭脂蟲中胭脂紅酸［17］、食品中的糖精鈉［18］和薇菜中黃酮［19］的檢測方法比較，以及在水質(zhì)分析中總氮檢測方法的比較研究［20］。

本文以處理后的城市污水為研究對象，研究RP－HPLC和麝香草酚分光光度法（以下簡稱麝香草酚法）檢測硝酸鹽氮的方法對比試驗，針對不同的實驗條件和要求給出了建設(shè)性的建議。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

安捷倫（Agilent）HPLC 1100高效液相色譜儀：自動進樣器，十八烷基鍵合固定相（ODS）反相色譜柱，二極管陣列檢測器（DAD），Agilent ChemStation；

流動相緩沖溶液母液：磷酸二氫鉀2.381 6g，加水溶解，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，加約0.143mL濃磷酸，定容；

上海光譜（Spectrum Shanghai）721E型可見分光光度計；

上海精科雷磁PHS－3CpH計；

麝香草酚（百里酚）乙醇溶液（5g·L－1）；

氨基磺酸胺溶液（20g·L－1）：稱取2g氨基磺酸銨，用1＋4乙酸溶液溶解并稀釋為100mL；

硫酸銀硫酸溶液（10g·L－1）：稱取1.0g硫酸銀溶于100mL濃硫酸中，搖勻；

國藥硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（100mg·L－1），4℃保存；

試驗用水均為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑為分析純；

水樣來自本實驗室的微壓內(nèi)循環(huán)微生物城市污水處理反應(yīng)器處理的城市污水。

1.2 RP－HPLC檢測城市污水中的硝酸鹽氮

取流動相緩沖溶液母液25mL稀釋至1 000mL，得流動相A（pH＝3.3）。

流動相為乙腈：A＝8∶92（V／V）；流速0.8mL· min－1；色譜柱溫度30℃；進樣量10μL；二極管陣列檢測器檢測波長208nm。記錄硝酸鹽氮的色譜峰對應(yīng)的峰面積（A1）。

1.3 麝香草酚法檢測城市污水中的硝酸鹽氮

（1）取水樣適量加入25mL具塞比色管，加水至1mL；

（2）加入0.1mL氨基磺酸氨，混勻，放置5min；

（3）加入0.2mL麝香草酚（中央加入），2.0mL硫酸銀硫酸溶液，混勻，放置5min；

（4）加入8.0mL水，混勻；

（5）加入濃氨水9mL至溶液呈現(xiàn)黃色；

（6）加水至25mL，混勻；

（7）在420nm下進行分光光度檢測，記錄相應(yīng)的吸光度（A2）。

1.4 樣品前處理

對于有固體雜質(zhì)或渾濁的水樣應(yīng)先用濾紙過濾，否則無需過濾。

過濾后的水樣可用于麝香草酚法的檢測；而RP－HPLC檢測的水樣應(yīng)進一步進行微孔過濾，再進行RP－HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

RP－HPLC和麝香草酚法的檢測實質(zhì)都是共軛化合物在紫外—可見光區(qū)發(fā)生了共軛電子的躍遷，使其產(chǎn)生一定的吸光度，但檢測的目標(biāo)物和定量的依據(jù)不同。

RP－HPLC檢測硝酸鹽氮時，首先將水樣在色譜柱上實現(xiàn)混合組分的一一分離，接下來關(guān)注其中硝酸根的響應(yīng)值。硝酸鹽氮在溶液中以硝酸根離子的形式存在，由于硝酸根離子中存在共軛鍵∏64，因此在近紫外區(qū)（200～400nm）有吸收。因此在RPHPLC檢測硝酸鹽氮時，不需要考慮屏蔽干擾離子的問題。

在濃硫酸存在下，麝香草酚與硝酸鹽生成硝基酚化合物，在堿性溶液（濃氨水）中發(fā)生分子重排，產(chǎn)生黃色化合物，該物質(zhì)在可見光區(qū)（400～700nm）有吸收。由于水樣中存在多種物質(zhì)，為了防止其他成分生成的化合物干擾硝基酚化合物的可見光吸收，因此加入氨基磺酸銨消除亞硝態(tài)氮的干擾，加入硫酸銀消除氯離子的干擾。

通過原理對比可以發(fā)現(xiàn)，RP－HPLC和麝香草酚法檢測城市污水中的硝酸鹽氮有本質(zhì)的區(qū)別。RP－HPLC的檢測已經(jīng)排除了雜質(zhì)的干擾，而麝香草酚法需要通過掩蔽劑來消除干擾。還可以發(fā)現(xiàn)RP－HPLC是直接檢測硝酸根離子的，而麝香草酚法是先將硝酸根離子衍生化為硝基酚，在堿性條件下使其形成最大的共軛體系，產(chǎn)生更強的吸收，導(dǎo)致2種方法的檢測波長不同。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

2.2.1 RP－HPLC的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將2.0、5.0、10.0、15.0、20.0和25.0mg·L－1的6個不同質(zhì)量濃度的硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液按“1.2”的方法進行RP－HPLC分析，保留時間為1.745min，以色譜峰面積（A1）對質(zhì)量濃度（c1）做標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1）。

圖1 RP－HPLC檢測硝酸鹽氮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 麝香草酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別取10.0mg·L－1硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70和1.0mL按照“1.3”的方法進行分析，以吸光度（A2）對質(zhì)量濃度（c2）做標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖2）。

圖2 麝香草酚法檢測硝酸鹽氮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)問題探討

將2種硝酸鹽氮分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)數(shù)（見表1）進行對比，發(fā)現(xiàn)二者的線性范圍差距較據(jù)大，但有交叉，RP－HPLC的范圍寬，而麝香草酚法的范圍小，原因見“2.1檢測原理”。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度在10.00～25.00mg·L－1的樣品，采用前者檢測不需要稀釋，這不僅可以減少操作步驟，節(jié)省檢測時間，還能降低結(jié)果的誤差。針對處理后的城市污水中硝酸鹽氮含量高的特點，RP－HPLC更有優(yōu)勢。

盡管線性相關(guān)性（R2）有差異，但在城市污水的硝酸鹽氮檢測中（不是微量和痕量分析），對于結(jié)果的準(zhǔn)確性并沒有決定性的影響，因此這項不需要在方法選擇時作為主要因素。為了檢測更高質(zhì)量濃度的硝酸鹽氮水樣，將RP－HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測上限質(zhì)量濃度進一步擴大到30.00mg·L－1，相關(guān)系數(shù)下降為0.994，這體現(xiàn)了二極管陣列檢測器的缺點，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度繼續(xù)擴大時，響應(yīng)值（A1）相對降低，呈現(xiàn)出上凸曲線。在分析方法中，線性范圍和線性相關(guān)系數(shù)是一對矛盾，二者不能兼顧。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)數(shù)據(jù)

2.2.4 檢出限的對比研究

RP－HPLC和麝香草酚法的檢出限（見表1）分別為0.001和0.12mg·L－1，2種方法相差120倍。

2.3 城市污水分析結(jié)果對比

取城市污水處理后的水樣8份，分別進行RPHPLC（見圖3，保留時間tR為1.745min）和分光光度法的檢測，并對檢測結(jié)果進行對比研究（見表2）。

每個樣品做2次平行樣檢測，計算平行偏差（見式（1））。

圖3 RP－HPLC分析處理后的城市污水色譜圖

表2 水樣的檢測數(shù)據(jù)比較

式中：A（平行1）和A（平行2）為同一樣品的平行樣檢測值，RP－HPLC為峰面積，麝香草酚法為吸光度；ˉA為平行樣檢測值的平均值。

RP－HPLC的樣品平行偏差在0.01%～0.33%之間，麝香草酚法在0.83%～12%之間，前者的方法穩(wěn)定性明顯更好，檢測結(jié)果的重現(xiàn)性更好。

2種方法的對比偏差在－6.3%～8.3%之間，這需要進一步研究確定二者的準(zhǔn)確性。

2.4 檢測成本的對比

進行1個樣次的檢測，RP－HPLC需要3min，而麝香草酚法通常需要15min。在實際的樣品檢測中，通常是批量檢測，但在核算時間成本時，不能做簡單的累加。按連續(xù)進行10個樣次比較，RPHPLC平均每個樣次需要4min，而麝香草酚法需要6min。且在檢測過程中，RP－HPLC為全自動分析，而麝香草酚法則需要試驗人員不斷地加藥、測試和記錄數(shù)據(jù)，時間成本與操作者的熟練程度有很大關(guān)系，本試驗的操作者已經(jīng)對麝香草酚法非常熟悉，平均每個樣次還需要6min，顯然后者的時間成本更高。

從試劑消耗的角度分析（見表3），對100個樣次做核算，二者需要的藥品種類和數(shù)量都有顯著差異，RP－HPLC只需要3種藥品，且用量均不大，顯然該方法更環(huán)保，更符合綠色化學(xué)的理念。

兩種方法對樣品量的要求也有很大差異，RPHPLC需要0.5mL（只進樣10μL），而麝香草酚法需要1.00mL。這同時也決定了標(biāo)準(zhǔn)品用量的不同，影響了試驗成本。

表3 100樣次檢測使用試劑消耗比較

3 結(jié)語

本文研究了高質(zhì)量濃度硝酸鹽氮含量的水樣的檢測方法的對比，通過RP－HPLC和麝香草酚法的對比試驗，確定了RP－HPLC在檢測范圍、檢出限，平行偏差、試劑消耗、樣品用量和檢測時間這些方面都具有優(yōu)勢，給硝酸鹽氮檢測方法的選擇提供了參考。

RP－HPLC具有更寬的檢測范圍，更高的自動化程度，更低的檢出限，可實現(xiàn)完全自動化的分析。通過檢測結(jié)果的對比，RP－HPLC可以給出更可靠的結(jié)果。而分光光度法使用的儀器已被廣泛推廣，且經(jīng)過樣品前期的稀釋處理，可以彌補線性范圍小的缺點，因此在一段時期內(nèi)，仍會被廣泛應(yīng)用。綜合分析，反相高效液相色譜法在檢測處理后的城市污水中硝酸鹽氮方面更具優(yōu)勢。

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Comparison on nitrate nitrogen by detections of RP－HPLC and thymol UV－Vis spectrophotometry

JI Xiao－na，etc.
（School of Science，Changchun Institute of Technology，Changchun130012，China）

For the municipal sewage after treatment，the detecting experiments of RP－HPLC and Thymol UV－Vis Spectrophotometry have been made，and the comparisons between these two methods have been made on the linear range，detection limit，parallel deviation，method bias，detecting time，reagent consumption，and so on.The result shows：the linear range of RP－HPLC is 2.00～25.00mg·L－1，linear dependent coefficient（R2）is 0.999 93，detection limit is 0.001mg·L－1，the parallel deviation of samples is 0.01%～0.33%，detection time is 4mins，and only three reagents are used.The parallel deviation of Thymol UVVis spectrophotometry is 0.83%～11.84%，detection time is 6mins.When seven reagents are used，the method bias of PR－HPLC is－6.31%～8.27%relative to thymol UV－Vis spectrophotometry.

nitrate nitrogen；RP－HPLC；Thymol UV－Vis Spectrophotometry；municipal sewage

X832

：A

：1009－8984（2014）01－0001－04

10.3969／j.issn.1009－8984.2014.01.001

2013－11－22

國家自然科學(xué)基金（51078067）吉林省科技計劃項目（20122112）吉林省科技發(fā)展計劃項目（201205091）吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目（2013309）

紀曉娜（1977－），女（漢），黑龍江寶清，講師主要研究污水處理和色譜分析等。

＊通訊作者：邊德軍