脂質(zhì)體的制備及相關性質(zhì)的研究

王文節(jié)，盛皓宇，楊進孫，楊江華，喻艷林

(皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院 感染性疾病科，安徽 蕪湖 241001)

脂質(zhì)體(Lipsomes)是一種內(nèi)部包含水相的閉合囊泡狀結構，它是由天然磷脂或磷脂類似物在水中自發(fā)形成的。由于脂質(zhì)體具有類似細胞膜的結構，進入人體以后主要被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)吞噬而激活機體的自身免疫功能，繼而改變被包封藥物的體內(nèi)分布，使藥物主要在肝、脾、肺、骨骼等組織器官中蓄積[1-2]。自20世紀60年代開始，脂質(zhì)體就作為藥物載體開始應用，隨著生物技術的發(fā)展，近年來脂質(zhì)體作為藥物載體的研究越來越受到人們的重視[3]。

氯屈膦酸二鈉(disodium clodronate，CL2MDP)是一種人工合成的雙膦酸酯，化學名為二氯甲烷二膦酸二鈉四水鹽，多用于治療骨質(zhì)疏松、多種骨腫瘤引起的骨質(zhì)改變等，其作用機制之一是骨骼中破骨細胞(定居于骨骼中的巨噬細胞)吞噬與羥磷灰石結晶結合的CL2MDP 后，CL2MDP 在破骨細胞內(nèi)形成具有毒性作用的ATP 類似物，從而導致細胞內(nèi)能量代謝障礙，引起破骨細胞凋亡，進而減輕破骨細胞對骨質(zhì)的吸收[4]。制備包封CL2MDP的脂質(zhì)體可使該藥物在體內(nèi)得到緩釋，并具有靶向性、可控性等特點。因此，本實驗擬通過逆相蒸發(fā)法制備CL2MDP脂質(zhì)體，并對其穩(wěn)定性等進行相關研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，CSF1A 型超聲波裂解儀(上海超聲波儀器廠)，Hema 高速冷凍離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)，磁力攪拌器(南通科學儀器廠)，恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械五廠)，U-2800型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，H-400 透射電子顯微鏡(日本日立公司)，電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)等。

1.2 藥品與試劑 卵磷脂(美國Sigma公司)、膽固醇(Sigma公司)、CL2MDP(Sigma公司)，其余試劑均為分析純。

1.3 CL2MDP脂質(zhì)體的制備[5]分別精密稱取一定量的卵磷脂和膽固醇(7∶2)于燒杯中，加入適量氯仿溶解后再加適量溶有CL2MDP的溶液(有機溶劑與水溶液比例為3∶1)，磁力攪拌10 min，冰浴中間隙超聲振蕩5 min，56℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)至糊狀，再加少量PBS，再次減壓蒸發(fā)，除去氯仿，得脂質(zhì)體懸液。依次過0.8 μm、0.5 μm微孔濾膜，充入氮氣，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 包封率的測定 ①測定波長的選擇：利用clodronate 在硝酸存在下與銅離子形成有色復合物的特點，將其配成母液，用紫外可見分光光度計進行全波長掃描，確定其最大吸收波長在240 nm處。②標準曲線的制定：精密稱取CL2MDP適量配成10 mg/ml 的儲備液。分別精密移取該儲備液0.5 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml于5 ml試管中，加PBS至刻度，配成濃度為1、2、3、4、5、6 mg/ml的標準溶液，以PBS為對照，在240 nm處測定吸光度，以濃度Y對吸光度X進行線性回歸處理。得回歸方程為Y=14.244X-0.738 (r=0.998)，在0.5～10 mg/ml范圍內(nèi)線性關系良好。③測定包封率：將制備好的包藥脂質(zhì)體懸液離心(12 000 r/m,2 h,4℃)后，收集上清液，測其吸光度。代入方程算出藥物含量，即為游離藥物含量，包封率=(總藥量-游離藥物含量)/總藥量×100%

1.5 形態(tài)學觀察 取少量脂質(zhì)體懸液滴至載玻片上，用3%磷鎢酸復染，再滴至專用銅網(wǎng)上，自然揮干，用透射電鏡觀察并照相。測定50個脂質(zhì)體直徑,重復3 次，計算平均直徑。

1.6 穩(wěn)定性考察 離心加速實驗(1 000 r/m,5 min)，用分光光度計測脂質(zhì)體離心前后吸收峰處吸光度的變化，代入公式K=(A-A0)/A×100%。(K為穩(wěn)定性參數(shù)，A為離心前吸光度，A0為離心后吸光度，K值越小，脂質(zhì)體越穩(wěn)定)。將CL2MDP脂質(zhì)體混懸液，分別在冷凍(-20℃)、室溫條件下避光放置2個月，于試驗期間的0、1、2月末取樣，分別觀察外觀、包封率的變化。

1.7 凍融法對脂質(zhì)體包封率的影響 檢測凍融法、凍融次數(shù)對包封率的影響:取5份(每份1 ml)脂質(zhì)體懸液，-20℃低溫冷凍，室溫凍融，渦旋混合10 min，測定凍融前后每份的包封率；另取1 ml脂質(zhì)體懸液，-20℃ 低溫冷凍，室溫凍融，反復5次，分別測定包封率。

2 結果

2.1 脂質(zhì)體的形態(tài)及包封率 脂質(zhì)體呈乳白色，電鏡下觀察，可見脂質(zhì)體形態(tài)較為規(guī)則，近似呈圓球形，平均直徑(200±8)nm，為小單室脂質(zhì)體(圖1)，計算測得脂質(zhì)體包封率達(18.6±2.8)%。

2.2 脂質(zhì)體的穩(wěn)定性 通過離心加速實驗測得: A0=0.502，A=0.539，計算得Ke=6.8 %，可見，離心前后吸光度變化很小，具有良好的穩(wěn)定性。樣品在冷藏條件放置2個月后，脂質(zhì)體外觀無變化，未發(fā)現(xiàn)沉淀，仍為乳白色均勻混懸液，包封率從(18.6±2.8) % 降到(17.5±1.5) %；而在室溫條件下貯存時，脂質(zhì)體在1個月內(nèi)便出現(xiàn)不可逆性沉淀現(xiàn)象，顆粒變大，包封率從(18.6±2.8) % 降到(14.5 ±2.7) %。

2.3 凍融法對脂質(zhì)體包封率、穩(wěn)定性的影響

2.3.1 在5個對比試驗中，凍融處理較好地提高了包封率，凍融前包封率平均為18.47 %，凍融后則平均為21.89 %，并將數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學處理，結果如表1。

2.3.2 包封率隨之凍融次數(shù)多的增加而略有提高，但凍融3次后，包封率基本趨于穩(wěn)定(圖2)。

圖1 CL2MDP脂質(zhì)體的透射電子顯微鏡觀察(×40 000)

Fig 1 CL2MDP liposome observed by transmission electron microscope(×40 000)

圖2 凍融次數(shù)對脂質(zhì)體包封率的影響

Fig 2 The effects of freezy-thaw cycles on the encapsulation efficiency of liposome

表1 凍融前后脂質(zhì)體包封率變化(%)

Tab 1 Encapsulation efficiency before and after freeze-thaw treatment

樣本1 2 345包封率(%)凍融前18.5317.89 18.1619.0318.7218.47±0.45凍融后20.8620.1421.3223.3923.7421.89±1.59

配對t=6.216，P<0.05，差異有統(tǒng)計學意義

3 討論

脂質(zhì)體作為藥物載體，具有靶向性、無毒性、緩釋性、可控性及保護包封藥物等優(yōu)點。因此已經(jīng)大量應用在生物、食品、醫(yī)藥、化工等領域。利用脂質(zhì)體的天然靶向性將藥物導入單核內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)，借助脂質(zhì)體緩釋作用可以延長藥物的作用時間和提高體內(nèi)藥物的濃度，從而提高療效[6-7]。脂質(zhì)體的制備方法已報道的有10余種，不同的制備方法包封率差別很大，本研究根據(jù)藥物的性質(zhì)和劑型的特點，選擇逆相蒸發(fā)法制備CL2MDP脂質(zhì)體，并在實驗中考察了脂質(zhì)體在室溫及凍融條件下的包封率，采用凍融處理后其包封率有一定程度的提高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但超過三次后包封率基本趨于穩(wěn)定。這說明脂質(zhì)體在常規(guī)貯存條件是一種不穩(wěn)定體系，藥物在內(nèi)外相均可通過脂質(zhì)雙分子層之間的孔隙，在濃度梯度作用下進行擴散。這也為以后對脂質(zhì)體的制備及其包封率、穩(wěn)定性等的控制方面提供了新的研究思路。

以往清除巨噬細胞多選用硅石粉、石棉粉、愛蘭苔膠等，但這些方法清除單核/巨噬細胞效率低，而且在清除單核/巨噬細胞的同時，對非吞噬細胞也有明顯的影響。LE-CL2MDP(氯屈膦酸二鈉脂質(zhì)體)是Van Rooijen[8]發(fā)現(xiàn)的清除巨噬細胞的方法，LE-CL2MDP被巨噬細胞選擇性地攝取后，溶酶體釋放的磷脂酶分解脂質(zhì)體使CL2MDP 釋放出來，導致巨噬細胞死亡。目前，CL2MDP主要用于骨科疾病的治療，但CL2MDP脂質(zhì)體卻廣泛應用于研究巨噬細胞功能[9]和某些免疫性疾病的實驗治療等研究方向[10]。本實驗制備的脂質(zhì)體小而均勻，電鏡下呈圓形或橢圓形，輪廓清晰，分散性良好，包封率較高，穩(wěn)定性良好。而且該方法所用設備簡單，易于操作，重現(xiàn)性好，為CL2MDP脂質(zhì)體的體內(nèi)外實驗研究奠定了基礎。

【參考文獻】

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