原花青素對(duì)體外阿爾茨海默病的預(yù)防作用

馬玉紅，竇德宇，柳春燕，武其文

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 診斷學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002;2.皖南醫(yī)學(xué)院 中心實(shí)驗(yàn)室,安徽 蕪湖 241002;3.皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241001)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是全球多發(fā)病、疑難病，目前尚無(wú)有效治療方法。目前研究證實(shí)氧化應(yīng)激損傷是其重要的發(fā)病機(jī)制之一[1-2]。據(jù)此推測(cè)具有抗氧化和抗炎的藥物可能具有預(yù)防和治療AD的作用。原花青素(procyanidins,PC)為葡萄籽中提取的多酚化合物，相關(guān)研究證實(shí)其有明顯的抗氧化、抗炎作用[3]。本研究旨在觀察PC能否改善H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，以期為AD的臨床防治提供新的參考。

1 材料和方法

1.1 藥品及試劑 PC(南京學(xué)子醫(yī)化研發(fā)中心提供，為葡萄籽提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95%)，30%H2O2溶液 (天津市東方廣誠(chéng)醫(yī)藥化工有限公司)， Tempol標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich公司)， DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清(Hyclone公司)，PC12細(xì)胞系購(gòu)自中科院細(xì)胞所，硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)雙抗體一步夾心法酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20140101A；總超氧化物歧化酶(total-superoxide dismutase，T-SOD)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20131122)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20131221)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器 Shellab水套式CO2培養(yǎng)箱、Sigma冷凍離心機(jī)、Epoch全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀等由皖南醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞在DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中加10%胎牛血清、青霉素100 U/ml及鏈霉素100 mg/ml，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照1∶3比例每2 d傳代1次。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組(0 μmol/L H2O2)、模型組(100 μmol/L H2O2)、陽(yáng)性藥物Tempol組(Tempol 800 μmol/L+100 μmol/L H2O2)、PC高劑量組(PC 80 mg/L+100 μmol/L H2O2)，PC中劑量組(PC 40 mg/L+100 μmol/L H2O2)，PC低劑量組(PC 20 mg/L+100 μmol/L H2O2)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞以1×106/L的濃度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁狀態(tài)穩(wěn)定后，分別加入終質(zhì)量濃度原花青素80 mg/L，40 mg/L，20 mg/L，Tempol 800 μmol/L預(yù)處理0.5 h后，再加H2O2100 μmol/L共孵育18 h后收集上清液和細(xì)胞檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.3 ELISA測(cè)定上清液中Trx濃度 給藥結(jié)束后吸取各組的培養(yǎng)液用作Trx檢測(cè)。具體方法參照Trx酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定上清液中的Trx吸光度值，計(jì)算Trx濃度。

1.3.4 測(cè)定細(xì)胞勻漿中的T-SOD活力和上清液中的MDA含量 給藥結(jié)束后直接吸取細(xì)胞上清培養(yǎng)液進(jìn)行MDA含量檢測(cè)；然后用溫PBS洗滌3次，用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，然后將細(xì)胞反復(fù)凍融，待細(xì)胞變成碎片時(shí)離心，吸取上清進(jìn)行檢測(cè)T-SOD活力。具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 PC對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Trx濃度的影響 正常組Trx表達(dá)量較高，模型組則顯著降低，與正常組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PC高、中劑量組、Tempol組Trx表達(dá)量較模型組明顯增高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 PC對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞T-SOD活力和MDA含量的影響 正常組SOD活力較高、MDA含量較低，模型組與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PC高、中劑量組、Tempol組T-SOD活力較模型組明顯增高，而MDA含量則明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，見(jiàn)表2。

組別劑量(mg/L)Trx(pg/ml)正常組211.60±18.56模型組50.77±10.97**Tempol組800 μmol172.94±82.67##PC高劑量組80 135.31±12.15#PC中劑量組40 125.26±48.23#PC低劑量組20 106.19±24.75F值5.309P值<0.01

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別劑量(mg/L)T-SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)正常組10.81±2.460.76±0.28模型組4.46±1.26**3.70±2.28**Tempol組800 μmol9.53±3.07##1.27±0.56##PC高劑量組80 9.40±1.45##1.52±0.51##PC中劑量組40 8.52±0.86##1.90±0.51##PC低劑量組20 6.69±0.642.96±1.1F值6.2258.041P值<0.01<0.01

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤分化的細(xì)胞株，是一種兒茶酚胺能細(xì)胞，能合成貯存并釋放適量的兒茶酚胺(主要是多巴胺和去甲腎上腺素)，具有典型的神經(jīng)細(xì)胞特征，常用于神經(jīng)細(xì)胞死亡方式和神經(jīng)毒性損害研究[4]。研究PC12細(xì)胞的損傷保護(hù)機(jī)制，可以針對(duì)靶點(diǎn)篩選大量化合物，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病藥物開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)。故本研究采用H2O2100 μmol/L損傷PC12細(xì)胞建立阿爾茨海默病模型。結(jié)果顯示H2O2可引起PC12細(xì)胞Trx和SOD活力顯著下降，MDA含量顯著升高，細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，增加過(guò)氧化物和過(guò)亞硝酸鹽的生成，增強(qiáng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化，與以往研究結(jié)果相似[5]。

Trx系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)行使氧化還原調(diào)控的重要功能[6]。若細(xì)胞內(nèi)的Trx受到抑制，勢(shì)必破壞氧化還原平衡和正常的生長(zhǎng)調(diào)控。SOD是細(xì)胞內(nèi)源性的抗氧化酶類(lèi)，SOD酶活性與體內(nèi)氧自由基和氧化應(yīng)激水平關(guān)系密切[7]。SOD用于對(duì)抗氧自由基的損傷作用，可將其轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬?duì)低毒性的物質(zhì)。研究顯示提高抗氧化酶的活性可對(duì)不同形式的氧化性損傷具有保護(hù)作用；MDA是氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸的終產(chǎn)物，MDA含量的變化可反映細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基的情況[8-9]。

本研究顯示給予不同劑量的PC后可使PC12細(xì)胞抗氧化酶Trx和SOD活力增加；MDA含量下降，顯示較好的細(xì)胞保護(hù)作用，本課題組前期研究結(jié)果也顯示PC可改善AD大鼠的行為學(xué)改變[10]，以上研究為臨床預(yù)防和治療AD提供一定的參考。本研究結(jié)果顯示，PC對(duì)PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用機(jī)理可能與抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。由于氧化應(yīng)激所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相互交聯(lián)而且復(fù)雜，PC對(duì)PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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