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    眼鏡蛇毒對成年大鼠脊神經(jīng)節(jié)BDNF和c-jun表達(dá)的影響

    2014-06-27 13:02:24周榮海熊克仁
    關(guān)鍵詞:傷害性眼鏡蛇蛇毒

    周榮海,丁 見,熊克仁

    (皖南醫(yī)學(xué)院 人體解剖學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002)

    眼鏡蛇毒是眼鏡蛇毒腺分泌的毒液,具有血液毒性和神經(jīng)毒性[1]。蛇毒可以改變周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的興奮傳遞,從而影響正常的神經(jīng)調(diào)節(jié)活動[2]。脊神經(jīng)節(jié)是機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境與脊髓連結(jié)的紐帶,接受外周初級感覺信息的傳入進(jìn)而將其傳送到中樞。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neorotrop-hin factors,BDNF)是豬腦中分離出來的一種堿性蛋白,是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員,對神經(jīng)元有維持和修復(fù)功能。即刻早基因(immediate early response genes,IEGs)c-jun是參與周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能活動的調(diào)控基因之一,正常情況下表達(dá)非常少,但機(jī)體受到刺激時其表達(dá)會增多[3]。目前,尚未見有關(guān)眼鏡蛇毒對脊神經(jīng)節(jié)中BDNF和c-jun表達(dá)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)方法觀察眼鏡蛇毒對脊神經(jīng)節(jié)BDNF和c-jun表達(dá)的影響,為探討眼鏡蛇毒中毒機(jī)制提供相關(guān)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 蛇毒 眼鏡蛇毒(干毒,由安徽省黃山市屯溪毒蛇養(yǎng)殖研究所提供)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)用SD雄性大鼠24只(由皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供),體質(zhì)量(250±15)g。

    1.3 實(shí)驗(yàn)分組及方法 大鼠隨機(jī)分為3個組,即正常對照組、生理鹽水組和眼鏡蛇毒組,每組8只大鼠。眼鏡蛇毒組,將干粉狀眼鏡蛇毒與生理鹽水按1∶3比例稀釋后,于右大腿后外側(cè)按0.5 μl/kg量注入;生理鹽水組在同部位注入相同體積的生理鹽水;正常對照組不作處理。仔細(xì)觀察,若發(fā)現(xiàn)蛇毒組大鼠煩躁不安,呼吸急促伴嘯鳴音等中毒癥狀特別明顯時,立即腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)處死;同時處死另外兩組大鼠。斷頭,取右側(cè)第5腰神經(jīng)節(jié),包埋成蠟塊后切片,厚5 μm,切片后脫蠟,依次進(jìn)行下面的步驟:3%雙氧水,室溫10 min,熱修復(fù)后冷卻,PBS洗3次,每次5 min;正常小牛血清封閉37℃1 h,PBS洗3次,每次5 min;滴加一抗BDNF(1∶150)、c-jun(1∶1 200),冰箱4℃過夜,PBS洗3次,每次5 min;第2天生物素化羊抗兔IgG(1∶100)復(fù)溫1 h,鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC 1∶100)液1 h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片后,光鏡下仔細(xì)觀察分析片子。

    1.4 神經(jīng)元計(jì)數(shù)及灰度值測定 在高倍視野下(×400)計(jì)數(shù)脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)BDNF和c-jun陽性神經(jīng)細(xì)胞,用Image J圖像分析軟件測量細(xì)胞平均灰度值。

    2 結(jié)果

    正常組、生理鹽水組及眼鏡蛇毒組大鼠的右側(cè)第5腰神經(jīng)節(jié)都有BDNF和c-jun表達(dá),BDNF和c-jun陽性細(xì)胞都呈棕黃色,主要為胞漿著色,著色都較均勻(見圖1、2),少量的細(xì)胞呈空泡樣;多數(shù)為大型細(xì)胞,也有中、小型細(xì)胞,其中BDNF陽性神經(jīng)元中大型細(xì)胞占總數(shù)70.7%,c-jun陽性神經(jīng)元中大型細(xì)胞占總數(shù)72.2%。右側(cè)第5腰神經(jīng)節(jié)生理鹽水組BDNF和c-jun平均灰度值和細(xì)胞數(shù)與正常對照組相比較均沒有差異(P>0.05);右側(cè)第5腰神經(jīng)節(jié)眼鏡蛇毒組較正常對照組和生理鹽水組平均灰度值顯著降低(P<0.01),細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.01,見表1)。

    A:正常對照組;B:生理鹽水組;C:眼鏡蛇毒組圖1 在大鼠脊神經(jīng)節(jié)中BDNF表達(dá)的情況(HPF×400)Fig 1 Expression of BDNF in spinal ganglion of rats(HPF×400)

    A:正常對照組;B:生理鹽水組;C:眼鏡蛇毒組圖2 在大鼠脊神經(jīng)節(jié)中c-jun表達(dá)的情況(HPF×400)Fig 2 Expression of c-jun in spinal ganglion of rats(HPF×400)

    眼鏡蛇毒組與生理鹽水組和正常對照組比較:﹡P<0.01,生理鹽水組和正常對照組比較:#P>0.05

    3 討論

    脊神經(jīng)節(jié)是脊神經(jīng)傳入第一級神經(jīng)元胞體的位置,是機(jī)體內(nèi)外環(huán)境與脊髓中樞聯(lián)結(jié)的紐帶,是多種神經(jīng)肽的制造場所和輸送站。通過脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)肽向中樞和外周端的輸入和釋放,從而調(diào)節(jié)和傳遞機(jī)體各種感覺信息。外周神經(jīng)的損傷會影響神經(jīng)肽的合成、輸送和釋放,進(jìn)而影響脊神經(jīng)節(jié)的功能。在形態(tài)學(xué)上,脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體直徑大于35 μm 為大型細(xì)胞,25~35 μm 為中型細(xì)胞,小于25 μm 為小型細(xì)胞[4]。本研究中觀察到的神經(jīng)元主要為大型細(xì)胞,BDNF陽性神經(jīng)元中大型細(xì)胞占總數(shù)70.7%,c-jun陽性神經(jīng)元中大型細(xì)胞占總數(shù)72.2%,這與大型神經(jīng)元主要在傳遞非傷害性感受和抑制傷害感受中起著重要作用相一致[5]。

    在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育過程中,BDNF能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、生長和分化并維持其生理功能[6]。當(dāng)坐骨神經(jīng)切斷后,背根神經(jīng)節(jié)中BDNF表達(dá)增加[7],Utley等在用BDNF注入膠原管治療坐骨神經(jīng)損傷的研究中發(fā)現(xiàn),BDNF有明顯的促神經(jīng)再生作用[8],對脊神經(jīng)節(jié)損傷可能具有保護(hù)作用[9]。本實(shí)驗(yàn)蛇毒組BDNF的高表達(dá),可能與眼鏡蛇毒中毒后BDNF對脊神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的修復(fù)和保護(hù)有關(guān)。有研究表明汞中毒后大鼠脊髓及脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)上調(diào)可加速BDNF的合成和分泌[10],本實(shí)驗(yàn)蛇毒組脊神經(jīng)節(jié)BDNF的表達(dá)顯著上調(diào)是否與膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)水平上升有關(guān),有待于進(jìn)一步研究。

    c-jun是即刻早基因之一,BDNF是c-jun的目的基因,即刻早基因可促進(jìn)BDNF的表達(dá)[11]。脊神經(jīng)節(jié)存在許多與傷害性刺激相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)[12],如c-jun、c-fos等。c-jun在神經(jīng)細(xì)胞信息傳導(dǎo)中起著重要作用,普遍存在于神經(jīng)系統(tǒng)中,在正常情況下表達(dá)較少。周圍神經(jīng)損傷后,神經(jīng)元在發(fā)生變性和再生的過程中,伴隨著神經(jīng)遞質(zhì)的變化,這可能是神經(jīng)細(xì)胞對傷害性刺激的反應(yīng)。有報(bào)導(dǎo)表明眼鏡蛇毒可顯著上調(diào)大鼠海馬CA1區(qū)c-fos和c-jun的表達(dá)[13],在坐骨神經(jīng)病變情況下,腰4和腰5脊神經(jīng)節(jié)在所有損壞的感覺神經(jīng)元中c-jun有大量的表達(dá)[14],說明c-jun可能與神經(jīng)損傷有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒組比正常對照組、生理鹽水組大鼠脊神經(jīng)節(jié)c-jun表達(dá)明顯增強(qiáng),這可能是機(jī)體對中毒后的一種傷害性刺激性反應(yīng)。在周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到傷害性刺激后,神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)再生反應(yīng),并伴隨c-jun基因表達(dá)上調(diào),提示c-jun在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)受損細(xì)胞修復(fù)以及改善神經(jīng)細(xì)胞的存活等方面發(fā)揮重要作用[15]。因此,本實(shí)驗(yàn)中眼鏡蛇毒組脊神經(jīng)節(jié)c-jun表達(dá)的增強(qiáng),可能是機(jī)體對蛇毒所致神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制之一。

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