發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒細(xì)胞表面受體的初步研究

張碩，李建東，曲靖，張福順，李川，梁米芳，李德新

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)醫(yī)學(xué)病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)屬布尼亞病毒科白蛉病毒屬。其基因組由大(L)、中(M)、小(S)3個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成，引起人嚴(yán)重發(fā)熱伴白細(xì)胞和血小板減少綜合征，住院患者病死率高達(dá)10%～30%。作為我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并主要在我國(guó)流行的新病原，人群普遍易感，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全[1]。目前SFTSV的致病機(jī)制尚不明確。病毒與宿主細(xì)胞表面分子結(jié)合是其感染細(xì)胞的首要環(huán)節(jié)，布尼亞病毒科病毒進(jìn)入細(xì)胞主要通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和pH依賴的膜融合過程實(shí)現(xiàn)[2,3]。近期研究結(jié)果顯示，樹突細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子3結(jié)合非整合素因子(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin，DC-SIGN)為多種白蛉病毒的受體[4]。在生物遺傳學(xué)上，SFTSV與其他白蛉病毒差異巨大，屬白蛉病毒屬的獨(dú)立分支。因此，DC-SIGN在SFTSV進(jìn)入細(xì)胞中的作用有待研究。本研究對(duì)DC-SIGN作為SFTSV的細(xì)胞表面受體進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

SFTSV HB29株由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒性出血熱室分離并傳代保存；Vero及CHO-K1細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，由本室傳代保存；病毒核酸提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit 購(gòu)自Qiagen公司；細(xì)胞核酸提取試劑盒RNeasy Mini Kit及SuperScriptTMⅢ Platinum One-Step qRT-PCR System為Invitrogen公司產(chǎn)品；PCR Nucleotide Mix、FuGENE?HD Transfection Reagent為瑞士Roche公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自英國(guó)Biolab公司；Anti-DC-SIGN mAb 1621 為美國(guó)R&D公司產(chǎn)品；引物及探針合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)不同細(xì)胞系DC-SIGNmRNA水平

選取Vero及CHO-K1細(xì)胞，計(jì)數(shù)后稀釋為5×105個(gè)/ml。各取1 ml細(xì)胞800 r/min離心5 min，用RNeasy Mini Kit 提取細(xì)胞總RNA，用實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DC-SIGN mRNA水平。引物及探針序列如下：DC-SIGN-F：TTCCAAGGAAACTGTTACTTCATG；DC-SIGN-R：GGAAGTTCTGCTCCTCAGCAC；DC-SIGN-Probe：FAM-ACTCCCAGCGGAACTGGCAC-BHQ-2。實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)體系及條件按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)不同細(xì)胞系SFTSV感染水平

對(duì)上述2種細(xì)胞系進(jìn)行計(jì)數(shù)，稀釋為5×105個(gè)/ml。取2 ml傳至6孔板，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，加入感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為1的SFTSV HB29毒株；37 ℃吸附1 h后吸出病毒液，用含2%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面3次，補(bǔ)入3 ml相同培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h。取140 μl 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)L、M、S 3個(gè)基因片段的RNA水平。引物及探針由本室設(shè)計(jì)合成并保存[5]，實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)體系及條件按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3DC-SIGN特異性單克隆抗體抑制SFTSV感染實(shí)驗(yàn)

將Vero細(xì)胞傳至96孔板，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)加入不同濃度的DC-SIGN單克隆抗體。將anti-DC-SIGN mAb 1621 用含1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)稀釋成5個(gè)濃度，分別為20、40、80、120和160 μg/ml。取50 μl加至細(xì)胞表面，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。37 ℃吸附1 h后吸出抗體，用PBS清洗細(xì)胞表面3次。加入MOI=1的SFTSV HB29毒株，37 ℃吸附1 h后吸出病毒液，用含2% FBS及1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面3次，補(bǔ)入200 μl相同培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h。取140 μl 細(xì)胞培養(yǎng)上清液，提取病毒RNA，實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)SFTSV RNA水平。

1.2.4DC-SIGN重組表達(dá)載體的構(gòu)建

利用RNeasy Mini Kit提取Vero細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后擴(kuò)增DC-SIGN基因片段。所用引物序列如下：DC-SIGN-PC-F：gggcGCTAGCATGAGTGACTCCAAGGAACC；DC-SIGN-PC-R：tgtgGCGGCCGCCTACGCAGGAGGGGGGTTTG。上述基因片段經(jīng)NheⅠ及NotⅠ雙酶切后克隆入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA5/FRT中，命名為pDC-SIGN。

1.2.5DC-SIGN表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后SFTSV感染實(shí)驗(yàn)

利用FuGENE?HD Transfection Reagent將pDC-SIGN轉(zhuǎn)染至上述2種細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞傳至6孔板，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用含2% FBS和1%谷氨酰胺的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面2次，補(bǔ)入2 ml相同培養(yǎng)基。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物：將2 μg質(zhì)粒加至100 μl Opti-MEM 中，每種質(zhì)粒加入5 μl FuGENE?HD Transfection Reagent。輕輕混勻后室溫靜置20 min，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加至培養(yǎng)基中混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h。取轉(zhuǎn)染后及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用MOI=1的SFTSV HB29毒株感染，37 ℃培養(yǎng)。分別于感染后6、12、24、48、72 h 收集病毒上清液，用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)SFTSV RNA水平。

2 結(jié)果

2.1 不同細(xì)胞系DC-SIGN mRNA 及SFTSV感染水平

用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)Vero及CHO-K1這2種細(xì)胞系中DC-SIGN mRNA水平及其經(jīng)SFTSV HB29毒株感染72 h后L、M、S 3個(gè)基因片段的RNA水平。結(jié)果如表1所示，Vero細(xì)胞中DC-SIGN mRNA水平較高，CHO-K1細(xì)胞中DC-SIGN mRNA水平較低。RNA檢測(cè)結(jié)果顯示，Vero細(xì)胞對(duì)SFTSV較敏感，而SFTSV在CHO-K1細(xì)胞中的感染復(fù)制水平比Vero細(xì)胞低。

表1 不同細(xì)胞系中DC-SIGN mRNA水平及感染SFTSV 72 h后病毒RNA水平Tab.1 DC-SIGN mRNA level and SFTSV RNA level after 72-hour infection in different cell lines

2.2 DC-SIGN單克隆抗體降低Vero細(xì)胞中SFTSV的感染水平

用anti-DC-SIGN mAb 1621封閉SFTSV敏感Vero細(xì)胞表面的DC-SIGN分子，通過實(shí)時(shí)RT-PCR初步評(píng)價(jià)DC-SIGN對(duì)病毒感染的影響。結(jié)果如圖1所示，隨著抗體效價(jià)逐漸增高，Vero細(xì)胞中SFTSV感染水平呈逐漸下降趨勢(shì)，表明DC-SIGN單克隆抗體在一定程度上能抑制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。

1, 20 μg/ml anti-DC-SIGN mAb; 2, 40 μg/ml anti-DC-SIGN mAb; 3, 80 μg/ml anti-DC-SIGN mAb; 4, 120 μg/ml anti-DC-SIGN mAb; 5, 160 μg/ml anti-DC-SIGN mAb.

2.3 DC-SIGN提高Vero和CHO-K1細(xì)胞中SFTSV的感染水平

將表達(dá)DC-SIGN的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Vero和CHO-K1細(xì)胞系，并于感染后6、12、24、48、72 h 收集病毒上清液，比較轉(zhuǎn)染前后SFTSV的感染水平。結(jié)果如圖2所示，2種細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染DC-SIGN后，SFTSV感染水平在不同時(shí)間點(diǎn)均較轉(zhuǎn)染前有一定程度增高，且病毒復(fù)制水平隨時(shí)間有逐漸增高的趨勢(shì)。結(jié)果表明，DC-SIGN可提高Vero和CHO-K1細(xì)胞中SFTSV的感染水平。

3 討論

病毒與宿主細(xì)胞表面分子結(jié)合是感染的第1步，開啟病毒進(jìn)入細(xì)胞的一系列動(dòng)態(tài)過程。許多受體是病毒組織嗜性和致病的決定性因素[6]，影響病毒的宿主范圍和種間屏障。明確病毒受體和病毒基因組中編碼受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或基序核苷酸序列，對(duì)有針對(duì)性地監(jiān)測(cè)環(huán)境中病毒動(dòng)態(tài)進(jìn)化過程、預(yù)測(cè)疫情的可能趨勢(shì)具有重要意義；同時(shí)病毒與受體相互作用也是抗病毒治療的潛在靶標(biāo)。因此，受體一直是病毒學(xué)研究的關(guān)注點(diǎn)，尤其在引起新發(fā)傳染病的病毒研究中始終是重點(diǎn)關(guān)注之一。病毒受體主要是細(xì)胞本來(lái)具有的受體，既可以是高度特化的蛋白，僅分布于特定的組織細(xì)胞，也可以是高度泛化的細(xì)胞膜成分，如整合素及其他細(xì)胞間黏附分子等。長(zhǎng)期以來(lái)一直對(duì)布尼亞病毒科病毒的細(xì)胞受體知之甚少[3,7]，近期研究結(jié)果顯示DC-SIGN分子為多種白蛉病毒的受體。

A: Vero cells. B: CHO-K1 cells.

本研究對(duì)DC-SIGN作為SFTSV的細(xì)胞表面受體進(jìn)行了初步研究，結(jié)果顯示DC-SIGN mRNA水平在SFTSV敏感Vero細(xì)胞中相對(duì)較高，而在CHO-K1細(xì)胞中相對(duì)較低。此外，DC-SIGN單克隆抗體在一定程度上能抑制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，且DC-SIGN可提高細(xì)胞中SFTSV感染水平。以上結(jié)果表明，DC-SIGN為SFTSV的可能受體，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

病毒與細(xì)胞相互作用時(shí)，既可通過細(xì)胞特異性受體方式相互作用，也可先后與多個(gè)受體相互作用，有的還需輔助受體參與。有研究結(jié)果顯示，不表達(dá)DC-SIGN的細(xì)胞也能被白蛉病毒屬相應(yīng)病毒感染[4]，而SFTSV除經(jīng)媒介生物傳播外，還可發(fā)生人與人之間的接觸傳播[8]，提示除DC-SIGN以外還有其他細(xì)胞受體存在。

[1] Yu XJ, Liang MF, Zhang SY, Liu Y, Li JD, Sun YL, Zhang L, Zhang QF, Popov VL, Li C, Qu J, Li Q, Zhang YP, Hai R, Wu W, Wang Q, Zhan FX, Wang XJ, Kan B, Wang SW, Wan KL, Jing HQ, Lu JX, Yin WW, Zhou H, Guan XH, Liu JF, Bi ZQ, Liu GH, Ren J, Wang H, Zhao Z, Song JD, He JR, Wan T, Zhang JS, Fu XP, Sun LN, Dong XP, Feng ZJ, Yang WZ, Hong T, Zhang Y, Walker DH, Wang Y, Li DX. Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China [J] . N Engl J Med, 2011, 364(16): 1523-1532.

[2] Ellis DS, Shirodaria PV, Fleming E, Simpson DI. Morphology and development of Rift Valley fever virus in Vero cell cultures [J]. J Med Virol, 1988, 24 (2): 161-174.

[3] Schmaljohn C, Nichol S. Bunyaviridae [M]. In: Knipe DM, Howley P. eds. Fields Virology. Volume 2. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2007: 1741-1789.

[4] Lozach PY, Kühbacher A, Meier R, Mancini R, Bitto D, Bouloy M, Helenius A. DC-SIGN as a receptor for phleboviruses [J]. Cell Host Microbe, 2011, 10(1): 75-88.

[5] Sun Y, Liang M, Qu J, Jin C, Zhang Q, Li J, Jiang X, Wang Q, Lu J, Gu W, Zhang S, Li C, Wang X, Zhan F, Yao W, Bi Z, Wang S, Li D. Early diagnosis of novel SFTS bunyavirus infection by quantitative real-time RT-PCR assay [J]. J Clin Virol, 2012, 53(1): 48-53.

[6] Schneider-Schaulies J. Cellular receptors for viruses: links to tropism and pathogenesis [J]. J Gen Virol, 2000, 81(Pt 6): 1413-1429.

[7] Walter CT, Barr JN. Recent advances in the molecular and cellular biology of bunyaviruses [J]. J Gen Virol, 2011, 92(Pt 11): 2467-2484.

[8] Gai Z, Liang M, Zhang Y, Zhang S, Jin C, Wang SW, Sun L, Zhou N, Zhang Q, Sun Y, Ding SJ, Li C, Gu W, Zhang F, Wang Y, Bian P, Li X, Wang Z, Song X, Wang X, Xu A, Bi Z, Chen S, Li D.Person-to-person transmission of severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus through blood contact [J]. Clin Infect Dis, 2012, 54(2): 249-252.