清益寧絡(luò)方對IgA腎病小鼠系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)的影響

夏欣欣，周冬枝，韓萍萍，曹麗君，袁 慧

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，陜西西安 710061)

IgA腎病(immunoglobulin A nephropathy, IgAN)是世界范圍內(nèi)最常見的腎小球疾病，我國IgAN占原發(fā)性腎小球腎炎的45.2%～58.2%[1]。IgA腎病的自然病程差異很大。最新研究首次報(bào)道了我國漢族成年IgAN患者的20年腎臟累計(jì)生存率67%，在確診后20年內(nèi)33%患者進(jìn)入終末期腎病(ESRD)[2]。系膜細(xì)胞(mesangial cell, MC)增殖，系膜基質(zhì)增生是IgA腎病的重要病理改變，增殖的MC分泌出一系列細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，使損傷進(jìn)一步擴(kuò)大，系膜細(xì)胞增生后可分泌大量炎癥因子并導(dǎo)致細(xì)胞外系膜基質(zhì)(ECM)的積聚，最終引起腎小球硬化。腎小球硬化和腎小管纖維化可與臨床血尿、蛋白尿、尿素氮、肌酐嚴(yán)重程度及臨床表現(xiàn)不一致，臨床表現(xiàn)輕但病理損傷重，是獨(dú)立于臨床的病理危險(xiǎn)因素之一[3]。本課題組臨床應(yīng)用清益寧絡(luò)方治療IgAN血尿、蛋白尿取得很好療效，故進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，了解該方對系膜細(xì)胞及ECM的影響和在IgA腎病腎纖維化進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)用藥牛血清白蛋白(BSA)由上海源聚生物科技有限公司提供，葡萄球菌腸毒素B(SEB)由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。

清益寧絡(luò)方由生黃芪、女貞子、旱蓮草、積雪草、黃蜀葵花、蒲黃、白茅根、當(dāng)歸、澤蘭共9味中藥組成，藥物購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房，按比例稱取后加水濃煎至3 g/mL；雷公藤多甙片，10 mg/片，為上海美通生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2實(shí)驗(yàn)動物及模型制作選用健康雄性ICR小鼠60只，體質(zhì)量18～20 g，6～7周齡，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

IgA腎病模型制作參照劉志紅等[4]報(bào)道的造模方法并進(jìn)行改良，采用復(fù)合法建立，即在口服免疫的同時(shí)，結(jié)合腹腔注射和靜脈注射。第1～6周，進(jìn)行預(yù)免疫，除正常組外，其余各組小鼠隔日按200 mg/kg體重口服1 g/L BSA酸化水(6 mmol/L鹽酸)，至12周末。第6周起定時(shí)腹腔注射BSA 0.2 mL/只，每日1次，連續(xù)3次。第8周起定期尾靜脈注射SEB，以無菌生理鹽水稀釋，劑量為0.4 mg/kg，每周1次，連續(xù)3周。

1.3分組及給藥方法適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，選取尿蛋白和尿紅細(xì)胞均為陰性的小鼠58只作為觀察對象，隨機(jī)分組。正常組(n=10)按1.2方法隔日飲用蒸餾水，至處死日，但第6周及第8周起腹腔、尾靜脈注射與造模等量、等次的蒸餾水。其余組按1.2方法造模后分為模型組(n=12)、雷公藤多甙組(n=12)及清益寧絡(luò)方低劑量組(n=12)、清益寧絡(luò)方高劑量組(n=12)。于實(shí)驗(yàn)第8周開始給藥，每日1次，連續(xù)5周。清益寧絡(luò)方高劑量組按每日36.4 g/kg(相當(dāng)于人常用劑量的20倍)，低劑量組按每日18.20 g/kg(相當(dāng)于人常用劑量的10倍)，雷公藤多甙組按每日5 mg/kg劑量分別灌胃，模型組及正常組分別灌服同等量的蒸餾水。在上述12周內(nèi)，各組動物自由飲水進(jìn)食。

1.4腎組織病理學(xué)觀察第12周末，斷脊處死小鼠，取右腎做石蠟包埋，包埋后切成4 μm的切片，分別進(jìn)行蘇木素伊紅(HE)、過碘酸雪夫反應(yīng)(PAS)染色，在光鏡下觀察腎小球的各種病理改變、系膜細(xì)胞增殖和系膜基質(zhì)增生程度。

1.5系膜基質(zhì)含量測定通過彩色病理圖像分析系統(tǒng)對系膜基質(zhì)含量進(jìn)行灰度測定。

1.6評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)腎小球系膜細(xì)胞計(jì)數(shù)方法[5]：采用3個(gè)正切腎小球的細(xì)胞數(shù)平均值作為細(xì)胞數(shù)，反映系膜細(xì)胞的增生程度。

腎小球系膜增生標(biāo)準(zhǔn)[6]：Ⅰ度(輕度)為系膜輕度增生，毛細(xì)血管未受壓或僅輕度受壓；Ⅲ度(重度)為系膜重度增生，以系膜基質(zhì)為主，毛細(xì)血管重度受壓；Ⅱ度(中度)為系膜增生程度介于輕重度之間。

ECM含量測定[7]：PAS陽性物質(zhì)含量代表系膜基質(zhì)，用PAS灰度值表示。圖像分析中，平均灰度用來表示圖像的透光率(分為256級，最黑為0級，最高為256級)。PAS陽性物質(zhì)平均灰度值越高，說明其免疫組化染色越淺，腎組織內(nèi)該物質(zhì)含量越低，即PAS灰度值與PAS陽性物含量成反比。采用圖像采集與分析系統(tǒng)，在200倍光鏡下測量每個(gè)腎小球的面積和陽性物質(zhì)灰度值，相除得出其單位面積的平均灰度。每組小鼠選取6只標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本測量5個(gè)大小相近的腎小球進(jìn)行測量，取其平均值作為該標(biāo)本的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠生存情況前6周各組小鼠狀態(tài)良好，6周起腹腔注射10 g/L BSA緩沖液及尾靜脈注射SEB后，模型組及雷公藤多甙組、清益寧絡(luò)方高劑量組、清益寧絡(luò)方低劑量組小鼠均有不同程度的攝食減少，精神萎靡，活動度減少，部分小鼠毛色無光澤，蓬松發(fā)黃，出現(xiàn)腹瀉，多于1周左右自行緩解，模型組表現(xiàn)較其他組嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)過程中，部分小鼠死亡(死亡原因與過敏反應(yīng)、進(jìn)食少、腹瀉及感染等有關(guān))，從實(shí)驗(yàn)中剔除，最終存活小鼠數(shù)為正常組10只，模型組8只，雷公藤多甙組9只，清益寧絡(luò)方高劑量組9只，清益寧絡(luò)方低劑量組8只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)正常組小鼠活潑好動，毛色光澤，狀態(tài)較好。

2.2光鏡下的病理觀察結(jié)果正常組無系膜細(xì)胞增殖及ECM增多；模型組系膜細(xì)胞明顯增殖，ECM增多，中重度增生為主，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，未發(fā)現(xiàn)球囊黏連及腎小球硬化；雷公藤多甙組、清益寧絡(luò)方高劑量組、清益寧絡(luò)方低劑量組系膜細(xì)胞增殖減輕，ECM輕度增多，輕中度增生為主，以清益寧絡(luò)方高劑量組減輕明顯(圖1)。

圖1各組小鼠腎組織的PAS染色

Fig.1 PAS staining of mouse kidney tissue in all the groups (×200)

A：正常組；B、C：模型組；D：雷公藤多甙組；E：清益寧絡(luò)方低劑量組；F：清益寧絡(luò)方高劑量組。

2.3各組ECM增生程度比較系膜基質(zhì)增生程度與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.004 5)；清益寧絡(luò)方高、低劑量組ECM增生程度組間比較及與雷公藤多甙組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.004 5，表1)。

表1各組小鼠系膜增生程度比較(秩和檢驗(yàn))

Tab.1 Comparison of mesenterium hyperblastosis in all the groups (Kruskal-Wallis H)

組別例數(shù)系膜基質(zhì)增生(例)正常Ⅰ度Ⅱ度Ⅲ度正常組1010000模型組*80026雷公藤多甙組#90171清益寧絡(luò)方 高劑量組#91530 低劑量組#80251

總組間P<0.01。多組間兩兩比較：與正常組比較，*P=0.000 3<0.004 5，與模型組比較，雷公藤多甙組#P=0.003 1<0.004 5，清益寧絡(luò)方高劑量組#P=0.002 4<0.004 5，清益寧絡(luò)方低劑量組#P=0.003 0<0.004 5。

2.4各組ECM的PAS灰度值比較模型組灰度值低于正常組及各藥物治療組，即模型組系膜基質(zhì)含量高于正常組及各藥物治療組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而清益寧絡(luò)方高劑量組灰度值明顯高于雷公藤多甙組，即系膜基質(zhì)含量低于雷公藤多甙組(P<0.05)，清益寧絡(luò)方低劑量組與雷公藤多甙組比較及高低劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2各組小鼠系膜基質(zhì)PAS灰度值比較

Tab.2 Comparison of mesangial matrix gray scale of PAS staining in all the groups

與正常組比較，*P=0.000 65<0.01；與模型組比較，雷公藤多甙組#P=0.000 92<0.01，清益寧絡(luò)方高劑量組#P=0.002 2<0.01，清益寧絡(luò)方低劑量組#P=0.005 1<0.01；與雷公藤多甙組比較，清益寧絡(luò)方高劑量組▲P=0.017 8<0.05。

2.5各組系膜細(xì)胞增殖結(jié)果各用藥組系膜細(xì)胞增殖與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與雷公藤多甙組比較，清益寧絡(luò)方高劑量組系膜細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而清益寧絡(luò)方低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。清益寧絡(luò)方高、低劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。

表3各組小鼠系膜細(xì)胞數(shù)比較

Tab.3 Comparison of mouse mesangial cells count in all the groups

組 別例數(shù)系膜細(xì)胞數(shù)(個(gè))正常組1030.20±1.67模型組848.58±3.69*雷公藤多甙組937.19±3.52#清益寧絡(luò)方高劑量組933.15±2.26#▲清益寧絡(luò)方低劑量組836.74±3.60#

與正常組比較，*P=0.000 21<0.01；與模型組比較，雷公藤多甙組#P=0.003 7<0.01，清益寧絡(luò)方高組劑量組#P=0.000 09<0.01，清益寧絡(luò)方低劑量低組#P=0.001 3<0.01；與雷公藤多甙組比較，清益寧絡(luò)方高劑量組▲P=0.041 2<0.05。

3 討 論

ECM積聚、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾病進(jìn)展的共同通路，IgA腎病也不例外。終末期腎病無特殊有效治療手段，但對早中期腎病進(jìn)行干預(yù)，防止其進(jìn)入腎功能衰竭期，對臨床具有重要意義。

ECM在腎臟的大量沉積是腎臟纖維化的重要病理基礎(chǔ)。其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，但總體是腎小球內(nèi)ECM合成過程增強(qiáng)和降解過程受到抑制的結(jié)果。已證明腎小球血液流動學(xué)改變能促進(jìn)系膜細(xì)胞合成ECM；活化的系膜細(xì)胞能產(chǎn)生更多的ECM成分；血管緊張素Ⅱ及內(nèi)皮素1等血管活性物質(zhì)和TGF-β等細(xì)胞因子的過度表達(dá)與分泌，均能引起ECM成分合成增多而導(dǎo)致ECM積聚。在腎小球損傷過程中，在細(xì)胞因子作用下，降解ECM的酶纖溶酶原激活物(PA)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性受到抑制，而纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)和金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPS)活性增強(qiáng)，呈高表達(dá)并逐漸占主導(dǎo)地位，使降解失平衡，引起ECM降解減少而發(fā)生積聚，最終發(fā)展至腎臟纖維化及腎小球硬化[8]。

腎小球系膜是位于腎小球毛細(xì)血管小葉的中央部分，由系膜細(xì)胞和ECM組成。系膜細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，通過自分泌或旁分泌方式參與腎小球炎癥反應(yīng)；系膜細(xì)胞可產(chǎn)生多種ECM，參與腎小球基膜的修復(fù)和更新，在病理情況下造成腎小球硬化；系膜細(xì)胞上有Fc受體和C3b受體，可參與免疫反應(yīng)[9]。系膜細(xì)胞在炎癥過程中不僅是被動受害者，其通過結(jié)構(gòu)和功能的改變直接影響炎癥的進(jìn)程。若系膜持久遭受損傷，炎癥過程會變成慢性，系膜細(xì)胞持續(xù)激活。因而，在IgA腎病早期，通過藥物治療的途徑對系膜細(xì)胞和ECM進(jìn)行干預(yù)，減輕腎組織病理改變，是防止纖維化的有效措施。

本研究采用HE染色觀察腎組織的基本病理改變，通過PAS染色觀察系膜細(xì)胞數(shù)量和ECM并根據(jù)ECM增生程度進(jìn)行病理分級。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組ECM中重度增生，系膜細(xì)胞增殖明顯；清益寧絡(luò)方組及雷公藤多甙組ECM輕中度增生，系膜細(xì)胞增殖較之模型組明顯減少，其中清益寧絡(luò)方高劑量組病理改變輕于雷公藤多甙組，說明該方能夠抑制系膜細(xì)胞增殖及ECM增生，其作用優(yōu)于雷公藤多甙。

由于PAS染色在腎臟病理學(xué)中常用來觀察ECM，PAS陽性物質(zhì)含量代表ECM，對陽性物質(zhì)灰度值進(jìn)行檢測來客觀評定腎臟細(xì)胞外基質(zhì)的變化。通過彩色病理圖像分析系統(tǒng)，對PAS灰度(ECM含量)的檢測表明，模型組腎組織內(nèi)ECM含量最高，清益寧絡(luò)方高劑量組較之雷公藤組有所減少，高低組間ECM含量變化無顯著差異。說明該方能減少腎組織ECM含量，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，其作用強(qiáng)于雷公藤多甙。

中國古代醫(yī)籍中沒有IgA腎病的病名或病癥，但根據(jù)其發(fā)展過程中的臨床表現(xiàn)及發(fā)病特點(diǎn)，歸屬于“水腫”“腰痛”“尿血”等中醫(yī)病癥范疇。本病乃本虛標(biāo)實(shí)之證，氣陰兩虛為本，風(fēng)熱、濕熱為標(biāo)，瘀血貫穿始終。在腎臟病理與中醫(yī)證侯分型的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，IgA腎病等以系膜增生為主的腎小球腎炎與氣陰兩虛證、陰虛證、氣虛證相關(guān)，其中氣陰兩虛證最多[10]。濕熱傷腎是腎炎病理的基本特點(diǎn)，且往往貫穿病程的始終。對于IgA腎病，從反復(fù)感染致病、局部炎癥浸潤、免疫復(fù)合物沉積、細(xì)胞因子等作用致系膜細(xì)胞增生和ECM增多，最后導(dǎo)致腎纖維化的過程看，可以認(rèn)為是在氣陰兩虛基礎(chǔ)上，濕熱致瘀，濕瘀交阻的病理結(jié)果。

清益寧絡(luò)方立足于IgA腎病的病因病機(jī)，以“清”和“補(bǔ)”為原則組方，由生黃芪、女貞子、旱蓮草、積雪草、黃蜀葵花、蒲黃、白茅根、當(dāng)歸、澤蘭共9味中藥組成，具有健脾補(bǔ)腎，活血化瘀，利濕降濁之功效。方中黃芪益氣固表、利水消腫為君藥；女貞子、旱蓮草能滋補(bǔ)肝腎之陰，并除虛熱；白茅根清熱涼血而不留瘀，起到標(biāo)本兼治的作用，共為臣藥；黃蜀葵花、積雪草清利濕熱，當(dāng)歸能活血化瘀，蒲黃、澤蘭既收斂止血，又行血祛瘀，止血效果較佳，共為佐使。方中各藥配合，補(bǔ)而不滯邪，通而不傷正，止血不留瘀，周到而主次有序，既扶正又祛邪。臨床研究證實(shí)該方對血尿蛋白尿有良好療效，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)該方具有抑制系膜細(xì)胞增殖及ECM沉積，減輕腎組織病理損害的良好作用，能延緩IgA腎病腎纖維化進(jìn)程，為臨床IgA腎病治療提供有效方藥。

參考文獻(xiàn)：

[1] 賈曉媛，王偉銘. IgA腎病的治療進(jìn)展[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012, 32(3):361-364.

[2] 彭用華，蘇穎，趙亞娟，等. IgA腎病牛津分型在腎臟預(yù)后評價(jià)中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2013, 35(1):102-107.

[3] 鄭法雷，陳香美．腎臟病臨床與進(jìn)展[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2005：54.

[4] 王浩，彭文，王云滿,等.葡萄球菌腸毒素B復(fù)合感染聯(lián)合5/6腎切除建立免疫球蛋白A腎病腎小球硬化模型[J]. 上海醫(yī)學(xué), 2012, 35(9):751-754.

[5] 黃文政，馬紅梅. 牛血清白蛋白和葡萄球菌腸毒素誘發(fā)小鼠IgA腎病的研究[C]. 第十二屆全國中醫(yī)腎病學(xué)術(shù)會議論文匯編:120-122.

[6] 王海燕. 腎臟病學(xué)[M]. 北京，人民衛(wèi)生出版社，2008：1007-1008.

[7] 劉文智，周淑紅. 胰島素抵抗和動態(tài)血壓在2型糖尿病腎病中的作用[J]. 中國臨床研究, 2011, 24(1):12-14.

[8] 劉寶玲，付彤，劉冰，等. 普樂可復(fù)對IgA腎病大鼠腎組織中MMP-9和TIMP-1表達(dá)水平的影響及其機(jī)制[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2014, 40(2):289-293.

[9] 段喜梅，張穎，劉璐，等. C3a、C5a及其受體在IgA腎病發(fā)病中的作用[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2013, 48(3):313-318.

[10] 張紅敏，王麗英. 腎小球系膜病理損害的中醫(yī)病機(jī)初探[J]. 陜西中醫(yī), 2004, 25(12):1121-1122.