大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞對RH-35肝癌細胞侵襲能力的影響

袁 博，陳昆侖，張 嵐，慕為民，王重民，劉保榮，徐 心

(西安交通大學醫(yī)學院：1.附屬西安市中心醫(yī)院，陜西西安 710004；2.第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710003)

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是起源于中胚層的一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，主要存在于骨髓組織與結(jié)締組織間質(zhì)中。MSCs已被廣泛用于組織修復(fù)與再生醫(yī)學研究，是可用于臨床細胞治療的理想“種子細胞”[1-3]。然而，近來有研究報道MSCs參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這對MSCs治療的生物安全性提出了挑戰(zhàn)。但MSCs對腫瘤的惡性行為具有正向還是負向調(diào)控作用尚存在爭議[4-6]。肝癌作為最常見的惡性腫瘤之一，其與MSCs間的相互作用關(guān)系尚不明確。本研究擬觀察大鼠骨髓MSCs條件培養(yǎng)基(MSCs-conditioned medium, MSCs-CM)對大鼠肝癌細胞株RH-35侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，并探討其可能的機制，為進一步探索MSCs在肝細胞癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與細胞 雄性清潔級SD大鼠，體質(zhì)量60～80 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物飼養(yǎng)與實驗操作符合《實驗動物管理條例》等法規(guī)的要求。大鼠肝癌細胞株RH-35由西安交通大學醫(yī)學院中心實驗室提供。

1.1.2主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、100 mm培養(yǎng)皿、6孔板(美國Gibco公司)；Transwell小室(美國Costar公司)；表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)(美國Peprotech公司)；Ficoll分離液、維生素C、胰島素、β-甘油磷酸鈉、地塞米松等(美國Sigma公司)；低糖型DMEM(LG-DMEM)培養(yǎng)基、高糖型DMEM(HG-DMEM)培養(yǎng)基、青鏈霉素(美國Hyclone公司)。

1.1.3主要設(shè)備 超凈工作臺(上海新苗醫(yī)療器械公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Revco公司)；高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；凝膠電泳儀器、電轉(zhuǎn)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠MSCs的分離與培養(yǎng) SD大鼠麻醉后，斷頸處死，于750 mL/L乙醇中浸泡20 min。無菌條件下分離出脛骨、股骨及肱骨，剪去干垢端，PBS溶液沖洗骨髓腔3～4次。利用無菌400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾沖洗液，收集濾液并吹打混勻，貼管壁緩慢加入等體積的Ficoll分離液的上層，1 500 r/min離心15 min，小心吸取中間層細胞，加入5 mL PBS充分吹打混勻，離心后棄上清液，同法再洗滌1次。細胞沉淀用含100 mL/L FBS、10 ng/mL EGF及100 IU/mL青鏈霉素的LG-DMEM培養(yǎng)基混懸計數(shù)，以1×105/mL接種于100 mm培養(yǎng)皿中。24 h后首次換液，棄去未貼壁細胞，此后每3 d換液1次。待細胞匯合率達85%左右時，胰酶消化，按1∶2比例傳代。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞集落、形態(tài)及排列極性。

1.2.2大鼠MSCs的分化鑒定 選取生長狀態(tài)良好的第5代MSCs，以1×104個/cm2密度接種于6孔板培養(yǎng)，24 h后將完全培養(yǎng)基吸棄，兩組細胞分別加入2 mL成骨分化誘導液(含100 mL/L FBS、0.2 mmol/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松的LG-DMEM培養(yǎng)基)、成脂分化誘導液(含100 mL/L FBS、0.5 mmol/L甲基異丁基黃嘌呤、10 mg/L胰島素、100 μmol/L吲哚美辛、10 μmol/L地塞米松的LG-DMEM培養(yǎng)基)，每3 d更換誘導液，14 d后成骨誘導組細胞行茜素紅染色，成脂誘導組行油紅O染色鑒定。

1.2.3大鼠骨髓MSCs培養(yǎng)上清液的獲取 將1×106/mL第5代MSCs接種于T25細胞培養(yǎng)瓶中，加入4 mL 無血清HG-DMEM，培養(yǎng)24 h后收集上清液，為MSCs-CM，0.22 μm濾器過濾后4 ℃保存。

1.2.4Transwell侵襲實驗 胰酶消化收集RH-35細胞，以1×106個細胞接種于培養(yǎng)皿中，貼壁后吸除培養(yǎng)液，隨后加入含不同濃度MSCs-CM的DMEM培養(yǎng)72 h。MSC-CM的濃度分別為0 mL/L、250 mL/L及500 mL/L。分別收集3組細胞，按照2×105/孔(100 mL無血清DMEM培養(yǎng)基)接種于Transwell上室，各組下室均加入500 μL含100 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基。37 ℃、50 mL/L CO2孵育48 h后，取出下室，漂洗與甲醛固定完畢，行Geisma染色，鏡下觀察并計數(shù)(平均計數(shù)8個視野)。

1.2.5Real time PCR檢測Snail與MMP-9 mRNA的表達 將80%匯合率的RH-35細胞等量接種于2個T25培養(yǎng)瓶中，待細胞完全貼壁后，其中1瓶加入500 mL/L MSCs-CM作為實驗組，另1瓶不添加作為對照組。培養(yǎng)72 h后，胰酶消化收集細胞，利用Trizol提取細胞總RNA。測定純度與濃度后，分別利用PrimeScriptTMRT reagent Kit(Takara)與SYBR?Premix ExTaqTM Ⅱ(Takara)試劑盒行RT-PCR反應(yīng)。

1.2.6Western blot檢測Snail與MMP-9蛋白的表達 分組方法同上。用ProteoJETTMCell Mammalian Lysis Reagent(Fermentas)提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白行120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，非特異性封閉；加入一抗Snail mAb、MMP-9 mAb，4 ℃過夜孵育，PBST洗脫后加入辣根過氧化物酶標記的二抗進行雜交。ECL發(fā)光劑顯色，培清凝膠成像分析儀拍照，用Quantity One軟件分析。數(shù)值以各蛋白/β-actin的灰度比值表示相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1大鼠骨髓MSCs的形態(tài)與分化鑒定分離細胞經(jīng)多次換液、傳代后逐漸呈均一的長梭形，分布均勻(圖1)。MSCs經(jīng)成骨分化誘導2周后，茜素紅染色顯示細胞內(nèi)形成粗大的鈣化結(jié)節(jié)，呈紅色(圖1)；成脂誘導分化后，細胞增大，胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴，呈環(huán)狀或團簇狀，油紅O染色顯示脂滴呈橘紅色(圖1)。

圖1大鼠骨髓MSCs的形態(tài)與分化檢測

Fig.1 Morphology and differentiation ability of rat bone marrow derived MSCs (×100)

A：第5代MSCs光鏡下形態(tài)；B：成骨分化(茜素紅染色)；C：成脂分化(油紅O染色)。

2.2大鼠骨髓MSCs對肝癌細胞侵襲能力的影響應(yīng)用0 mL/L、250 mL/L及500 mL/L MSC-CM處理RH-35細胞后，細胞的侵襲率逐漸增加。與對照組相比較，500 mL/L MSC-CM 干預(yù)組細胞的侵襲率顯著增加，其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。選擇500 mL/L MSC-CM為目標干預(yù)濃度進行下一步實驗。

圖2不同濃度MSC-CM對RH-35侵襲能力的影響

Fig.2 Effect of MSC-CM of different concentrations oninvitroinvasiveness of RH-35 cell(*P<0.05,P=0.002 0)。

2.3大鼠骨髓MSCs對肝癌細胞Snail與MMP-9mRNA表達的影響對照組中大鼠肝癌細胞表達少量的Snail與MMP-9 mRNA，而在500 mL/L MSCs-CM處理后的細胞中，Snail與MMP-9 mRNA的表達量均顯著升高(P<0.05，圖3)。

圖3MSC-CM對RH-35細胞Snail(B)與MMP-9(A)mRNA表達的影響

Fig.3 Effect of MSC-CM on Snail (B) and MMP-9 (A) mRNA expressions in RH-35 cell (*P<0.05，PA=0.000 5，PB=0.002 4)。

2.4大鼠骨髓MSCs對肝癌細胞Snail與MMP-9蛋白表達的影響Western blot結(jié)果顯示，500 mL/L MSC-CM干預(yù)后，RH-35細胞Snail與MMP-9的蛋白含量較對照組顯著升高，其差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。表明MSC-CM可促進大鼠肝癌細胞RH-35中Snail與MMP-9蛋白的表達。

3 討 論

肝癌是臨床上最常見的惡性實體腫瘤之一，具有較早發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)率高等特點，這也是造成肝癌極差預(yù)后的主要原因。近年有研究表明，骨髓干細胞除在肝損傷的再生修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，而且參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展[7-8]。研究骨髓干細胞在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移進程中的作用具有重要意義。MSCs是骨髓干細胞家族中的重要成員，與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不明確，文獻報道甚少。本實驗采用體外共培養(yǎng)的方法，結(jié)果表明，MSCs可以對肝癌細胞RH-35侵襲能力有促進作用，與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的指標Snail及MMPs的表達水平也明顯升高。這一結(jié)果與KARNOUB等[5]報道相似，認為MSCs能夠顯著提高乳腺癌細胞的侵襲能力，促進乳腺癌發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。這表明MSCs是可以影響肝癌的發(fā)展及術(shù)后復(fù)發(fā)，應(yīng)值得重視并深入探討。

圖4MSC-CM對RH-35細胞Snail與MMP-9蛋白表達的影響

Fig.4 Effect of MSC-CM on Snail and MMP-9 protein expressions in RH-35 cell(*P<0.05，PSnail=0.000 1，PMMP-9=0.000 1)。

本研究采用MSCs-CM進行共培養(yǎng)實驗，發(fā)現(xiàn)MSCs-CM能顯著提高肝癌細胞的侵襲能力，說明至少MSCs的旁分泌機制在對腫瘤的作用中發(fā)揮了作用。既往研究報道，MSCs-CM含有大量的細胞因子，包括VEGF、TGF等，這些因子可能通過促腫瘤血管新生、癌細胞的間質(zhì)、免疫抑制等作用促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)等惡性行為[9-11]。

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是一個多因素共同介導及參與的復(fù)雜病理過程，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的降解與基底膜的破壞降解是其中的關(guān)鍵步驟之一，依賴于的蛋白水解酶的表達與激活。明膠酶MMP-2/9是體內(nèi)降解Ⅳ型膠原蛋白與層粘連蛋白的主要酶類，Ⅳ型膠原蛋白是組成ECM的基本骨架。明膠酶通過破壞基質(zhì)的降解平衡而可促進腫瘤細胞突破其組織學屏障，侵襲鄰近組織和轉(zhuǎn)移至遠處組織[12]。相比MMP-2，MMP-9與肝癌侵襲及不良預(yù)后關(guān)系更為密切，MMP-9可作為反映肝癌轉(zhuǎn)移潛能、復(fù)發(fā)及預(yù)后的生物學指標[13-14]。

Snail是新近發(fā)現(xiàn)的鋅指樣核轉(zhuǎn)錄因子。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面，Snail是上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的主要調(diào)控因子，誘導上皮來源的腫瘤細胞發(fā)生間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細胞易于脫離原定植部位，發(fā)生轉(zhuǎn)移[15]。由于本研究Transwell實驗結(jié)果表明500 mL/L MSCs上清液對肝癌細胞的遷徙能力作用最為明顯，因此后續(xù)實驗選擇檢測500 mL/L MSC-CM濃度孵育下肝癌細胞侵襲相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄與表達。PCR與Western blot結(jié)果均表明，經(jīng)過MSC-CM作用后，RH-35細胞中Snail與MMP-9的表達明顯升高。MARTIN等[9]將乳腺癌細胞系與MSCs分別進行直接/間接共培養(yǎng)后，乳腺癌細胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，表達穩(wěn)定的間質(zhì)表型(Snail、Twist、Vimentin等)；同時，癌細胞抗凋亡、血管形成、遷移及侵襲相關(guān)基因水平也顯著提高。目前，研究多認為Snail是MMP-9的上游調(diào)節(jié)蛋白。在MDCK上皮細胞中，Snail可通過MAPK與PI3K信號通路來激活MMP-9的轉(zhuǎn)錄與表達，兩者的表達與細胞的侵襲能力相關(guān)[16]。另有研究表明，Snail可以通過上調(diào)MMPs的表達來促進肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移，與肝癌的不良預(yù)后相關(guān)[17]。因此，我們推斷MSCs促進肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制可能是與Snail的活化有關(guān)，MSCs通過激活Snail介導的MMP-9的表達上調(diào)發(fā)揮促侵襲效應(yīng)。

但是，也有研究認為MSCs能抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。LI等[18]將人MSCs-CM與人肝癌細胞系MHCC97-H共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs可以顯著抑制癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。我們認為，出現(xiàn)這種截然不同的報道結(jié)果，可能與實驗所采用的肝癌細胞特性和選擇的MSCs不同有關(guān)。既往研究表明，MSCs對不同類型乳腺癌細胞的增殖與侵襲也發(fā)揮不同的調(diào)控作用[5,9]。這也證實了MSCs對腫瘤惡性行為的作用具有復(fù)雜性與雙向調(diào)節(jié)性。

總之，MSCs對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響涉及到諸多方面的因素，對其影響的機制還不十分明確。進一步明確MSCs與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系及其機制將是我們迫切需要解決的問題。

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