高表達FGFR4細胞株的建立及其生物活性分析

黃 靜，安紅麗，張 濤

(西安交通大學醫(yī)學院：1. 藥物研究所；2. 第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，陜西西安 710061)

成纖維細胞生長因子受體4(fibroblast growth factor receptor 4, FGFR4)屬于FGFR家族成之一，其結(jié)構(gòu)包括細胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、疏水跨膜區(qū)和細胞質(zhì)含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。FGFR4有廣泛的生物學功能，具有調(diào)節(jié)細胞增殖、存活、遷移和分化的能力[1-7]，F(xiàn)GFR4信號通路的激活在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[8-9]。例如，腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和抗凋亡均有重要作用[10-12]。最近報道FGFR4在MDA-MB-453細胞中高表達有助于細胞耐藥性的出現(xiàn)[13]。因此，構(gòu)建高表達的FGFR4細胞，建立受體特異的細胞模型，不僅有助于研究FGFR4的生物學功能，也為以FGFR4為抗腫瘤藥物篩選靶標提供了體外篩選的模型。在本實驗中，以穩(wěn)定的條件選擇構(gòu)建高表達FGFR4細胞，然后研究HEK293/FGFR4細胞周期和HEK293/pcDNA細胞以解釋抑制細胞的增殖。此外，檢測與增殖相關的信號通路蛋白，如ERK和p-ERK。我們用HEK293細胞系來確定FGFR4的生物學效應，表明FGFR4是細胞增殖的重要受體之一。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑FGFR4(sc-124)和β-actin(sc-10731)購自Santa Cruz。ERK1/2(#9102)和磷酸化ERK1/2(#4370)購自Cell Signal公司，辣根過氧化物酶標記的小鼠IgG購自ZSBio公司，兔IgG購自Jackson ImmunoResearch公司，PI(碘化丙啶)、DMSO(二甲亞砜)、MTT[3-(4，5-二甲基吡啶-2-基)-2，5-二苯基溴化]均購自Sigma。

1.2引物設計和PCR產(chǎn)物擴增FGFR4基因擴增片段引物設計及擴增pOTB7/FGFR4質(zhì)粒(Open Biosystem公司Huntsville, USA)含有FGFR4基因全序列，應用PCR技術(shù)對FGFR4基因進行擴增。FGFR4引物序列：正向引物5′-AGTAAGCTTATGCGGCTGCTGCTGGCCCT-3′，引入HindⅢ識別序列；反向引物5′-GATCTCGAGTCATGTCTGCACCCCAGACC-3′，引入XhoⅠ識別序列。PCR 反應體系：pOTB7/FGFR4 1 μg，F(xiàn)GFR4-f 0.2 μmol/L，F(xiàn)GFR4-r 0.2 μmol/L，dNTP 25 mmol/L，10×LA PCR Buffer 2.5 μL，LATaq2U，加入去離子水至總體積25 μL。擴增反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，30個循環(huán)，72 ℃總延伸10 min。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并純化(參照膠回收試劑盒，Omega)。

1.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建使用HindⅢ和XhoⅠ將FGFR4的PCR片段及表達載體pcDNA3.1(+)雙酶切。酶切反應體系：FGFR4-pcDNA3.1(+)1 μg，10×K Buffer 2 μL，HindⅢ 15 U，XhoⅠ 15 U，ddH2O補至20 μL，37 ℃反應4 h。

將酶切后的產(chǎn)物用膠回收試劑盒進行回收得到目的基因和載體片段。用T4 DNA Ligase將FGFR4基因及載體片段酶切產(chǎn)物進行連接。連接反應體系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 U，pcDNA3.1(+)30 ng，F(xiàn)GFR4 100 ng， ddH2O補至10 μL，4 ℃過夜連接。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coliDH5α(全式金，北京)。吸取100 μL感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，加入連接產(chǎn)物10 μL，輕彈混勻，冰中放置30 min，移至42 ℃恒溫水浴中，放置90 s，快速冰浴使細胞冷卻3 min，加入800 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃恒溫搖床，低速培養(yǎng)1 h復蘇細菌，以800 r/min離心3 min，棄去800 μL上清液，將沉淀重懸后轉(zhuǎn)移至含Ampr抗性的LB固體培養(yǎng)基上，三角玻璃棒將菌液涂勻。倒置平皿，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。

1.4重組質(zhì)粒FGFR4-pcDNA3.1(+)的提取和鑒定挑取單克隆菌落，溶于含Ampr的LB培養(yǎng)基的玻璃試管中，37 ℃恒溫搖床過夜。提取質(zhì)粒(按試劑盒步驟操作，天根)，進行HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定(酶切體系同1.3)。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送杭州金斯瑞測序，對FGFR4基因序列進行驗證。選擇無堿基突變、缺失質(zhì)粒進行下一步實驗。

1.5細胞系的細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選Huh7細胞系作為FGFR4陽性對照，MDA-MB-231和MCF-7細胞系作為陰性對照。所有的細胞系在含有DMEM(Invitrogen公司)和100 mL/L FBS(類標準胎牛血清，蘭州民海)、100 U/mL的青霉素G鈉、100 μg/mL的硫酸鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。應用脂質(zhì)體法(LipofectamineTM2000，Invitrogen公司)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞。過程如下：①2 μg質(zhì)粒稀釋于200 μL的Opti-MEM?I培養(yǎng)基中，室溫下孵育10 min。在同一時間，7 μL的LipofectamineTM2000加入200 μL的Opti-MEM?I培養(yǎng)基中混勻，靜置10 min。②將稀釋的DNA與稀釋的脂質(zhì)體輕輕混合，并在室溫下孵育20 min。③將DNA-脂質(zhì)體均勻滴加至無抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基中混勻，在CO2培養(yǎng)箱中孵育4～6 h，換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。④將轉(zhuǎn)染的HEK293細胞移入10 cm培養(yǎng)皿，加入含有G418(800 μg/mL)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3周，隔天換液，得到單克隆抗性細胞集落。⑤在含有G418(300 μg/mL)培養(yǎng)基中將陽性細胞克隆擴大培養(yǎng)、凍存、保種。

1.6細胞免疫熒光染色法我們通過細胞免疫熒光染色觀察FGFR4蛋白的定位。①將篩選得到的HEK293-FGFR4和HEK293-pcDNA細胞鋪板在無菌玻璃片上，培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基并加入40 mg/mL多聚甲醛固定15 min，用10 μL/mL Triton X-100處理3 min。②50 mg/mL BSA室溫封閉細胞爬片2 h。③FGFR4(1∶100，Santa Cruz)在室溫下孵育4 h，PBST洗3次，每次5 min。④將cy3標記山羊抗兔抗體(Jackson ImmunoResearch 1∶200)在室溫下孵育1 h，PBST洗3次，每次5 min，DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚0.1 μg/mL)0.1 μg/mL室溫避光孵育15 min染色，熒光顯微鏡(Nikon Ti-u，Tokyo，Japan)觀察、分析FGFR4的定位及表達。

1.8細胞周期分布分析HEK293-FGFR4和HEK293-pcDNA細胞接種到6孔板中，在DMEM完全培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。當細胞匯合度達90%，胰蛋白酶消化細胞，PBS洗滌2次，750 mL/L的乙醇4 ℃固定30 min，PBS洗滌后用100 μg/mL RNAase A和碘化丙啶(PI，40 μg/mL)37 ℃孵育30 min，流式細胞儀(Becton Dickinason)分析細胞周期。

1.9蛋白樣品制備和免疫印跡分析總細胞裂解物在RIPA緩沖液中[0.1 mL/mL Triton X-100、1 g/mL Na deoxychlolate、1 mg/mL SDS、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)和5 mmol/L EDTA]含有PMSF 200 μmol/L和磷酸酶抑制劑，在冰上孵育30 min，超聲裂解未溶解蛋白，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集蛋白上清液加入5×sample buffer，沸水浴10 min。取常規(guī)方法進行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜，0.05 g/mL的脫脂奶粉封閉，一抗為phospho-ERK1/2(Thr202/Tyr204)(1∶1 000)、ERK1/2的抗體(1∶2 000)、FGFR4(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)。二抗為辣根過氧化物酶標記的小鼠IgG(1∶10 000)或兔IgG(1∶20 000)，ECL發(fā)光檢測。

2 結(jié) 果

2.1FGFR4的表達和定位選擇FGFR4高表達細胞系Huh7，MDA-MB-231和MCF-7細胞系作為陰性對照。FGFR4蛋白在HEK293-FGFR4細胞中表達，且表達量明顯高于陰性對照細胞組(圖1)。同時，免疫熒光分析了HEK293-FGFR4和HEK293-pcDNA3.1細胞中的FGFR4定位(圖2)。HEK293-FGFR4細胞的細胞膜的熒光強度比HEK293-pcDNA3.1細胞的亮度高，這表明FGFR4在HEK293-FGFR4細胞系中的表達高于在HEK293-pcDNA細胞系中的表達。FGFR4蛋白主要在細胞質(zhì)及細胞膜上表達。

圖1 免疫印跡分析FGFR4的表達量

圖2 免疫熒光分析FGFR4蛋白表達定位

2.2FGFR4對細胞增殖的影響在完全相同的培養(yǎng)條件下，HEK293-FGFR4細胞比HEK293-pcDNA細胞的增殖速度快。從第3天到第7天來看，HEK293-FGFR4細胞的增殖速度高于HEK293-pcDNA細胞，表明FGFR4能夠促進細胞增殖(圖3)。

圖3 細胞計數(shù)實驗檢測FGFR4對細胞增殖的影響

2.3FGFR4對細胞生長周期的影響建立流式細胞儀分析方法來檢測FGFR4的增殖影響。我們?nèi)∠嗤囵B(yǎng)條件下HEK293-FGFR4和HEK293-pcDNA細胞進行周期分析，發(fā)現(xiàn)HEK293-FGFR4細胞G0/G1比例為56.78%，低于HEK293-pcDNA細胞G0/G1比例44.95% (圖4)。證明FGFR4可降低G0/G1期比例，促進細胞增殖[14]。

2.4FGFR4對MAPK信號的影響我們初步分析FGFR4對HEK293細胞增殖影響的分子機制。ERK作為MAPK信號通路中的重要信號分子，其磷酸化導致MAPK信號通路激活，刺激靶細胞增殖。因此，通過對HEK293-FGFR4和HEK293-pcDNA細胞的p-ERK信號蛋白分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)HEK293-FGFR4 ERK蛋白磷酸化水平高于HEK293-pcDNA細胞。這些結(jié)果與以前在腫瘤細胞中的研究結(jié)果一致[15]，表明FGFR4能夠提高磷酸化ERK1/2信號蛋白水平，引起MAPK通路的激活。

圖4 FGFR4對HEK293細胞周期的影響

圖5 Western blot分析FGFR4對MAPK信號通路的影響

3討論

高表達的FGFRs經(jīng)常發(fā)生在人類的癌細胞中，并且與預后不良相關。在本研究中，我們構(gòu)建了包含F(xiàn)GFR4全基因的真核表達載體，并通過抗性篩選得到了高表達FGFR4蛋白的細胞株。同時，通過細胞增殖實驗、細胞周期分析、免疫印跡、免疫熒光實驗對HEK293-FGFR4細胞特性進行了初步研究。結(jié)果表明，我們成功構(gòu)建了高表達FGFR4的重組HEK293細胞株；免疫印記及免疫熒光分析結(jié)果表明，F(xiàn)GFR4在細胞膜上表達且表達量高于對照陰性細胞。為了驗證FGFR4是否具有生物學活性，進行了細胞增殖實驗及細胞周期分析，發(fā)現(xiàn)HEK293-FGFR4細胞的增殖速度比HEK293-pcDNA細胞快。細胞周期分析證實FGFR4促進了細胞G0/G1期降低。根據(jù)免疫印記結(jié)果分析，HEK293-FGFR4細胞中p-ERK1/2的表達水平高于HEK293-pcDNA細胞株，而p-ERK1/2水平的升高被證明有助于細胞增殖[13]。細胞生長周期分布表明FGFR4有助于HEK293細胞中G0/G1期的抑制過程。以前的研究表明乳腺癌細胞中FGFR4能夠促進G0/G1向S期的過渡[8]。研究結(jié)果表明FGFR4不僅能夠促進正常的高表達的腫瘤細胞而且能夠促進人工構(gòu)建的非腫瘤細胞的增殖。

總之，我們成功構(gòu)建了包含F(xiàn)GFR4基因的真核表達質(zhì)粒，pcDNA-FGFR4。FGFR4基因在HEK293細胞中可有效地表達，高表達的FGFR4能夠通過降低G0/G1期比例和提高p-ERK1/2水平來促進HEK293細胞的增殖。本研究不僅為研究癌癥中FGFR4的功能提供了實驗模型，同時建立了以FGFR4為靶標的抗腫瘤藥物體外篩選模型。

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