鈉、鉀干預對Dahl鹽敏感大鼠腎髓質(zhì)TGF-β1表達及纖維化的影響

徐海霞，白曉君，牟建軍，任珂宇，劉富強，鄭樹慧，王 丹，汪 洋，郭統(tǒng)帥

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西西安 710061)

鹽是高血壓最常見和最重要的環(huán)境因素之一，相對高鹽攝入會導致血壓升高，也能通過獨立的非血壓依賴途徑直接影響心、腦、腎等靶器官[1-2]。血壓的鹽敏感性是原發(fā)性高血壓的一種中間遺傳表型，鹽敏感高血壓者早期即可出現(xiàn)腎功能損害，且損害較嚴重[3]。鉀作為鈉的“拮抗劑”，可拮抗鹽介導的血壓升高，同時具有保護靶器官損害的作用[4]。本研究通過觀察高鹽及補鉀飲食對鹽敏感高血壓大鼠腎髓質(zhì)轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)β1的表達及纖維化的影響，探討鹽與TGF-β1之間的關系。

1材料與方法

1.1實驗動物健康雄性Dahl鹽敏感大鼠和SS-13BN大鼠，從美國Charles River公司引進，于西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心SPF級動物室飼養(yǎng)繁殖。SS-13BN大鼠作為Dahl鹽敏感大鼠的對照組，是Dahl鹽敏感大鼠的13號染色體置換為Brown Norway大鼠13號染色體后得到的鹽不敏感大鼠模型，與Dahl鹽敏感大鼠基因組98%同源性。

1.2試劑及儀器Trizol試劑(Sigma公司)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-PCR, RT-PCR)試劑盒(TaKaRa公司)；TGF-β1抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗鼠二抗免疫組化試劑盒(Santa Cruz Biotechnology公司)。MODEL-229大鼠無創(chuàng)血壓測定儀(美國IITC公司)；電泳裝置(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(美國Ultro-violet公司)；正置熒光顯微鏡BX51(奧林巴斯公司)。

1.3方法

1.3.1動物分組及飲食干預 6周齡健康雄性Dahl鹽敏感大鼠24只，分成鹽敏感大鼠低鹽組(salt-sensitivity rats given low salt, SLS)、鹽敏感大鼠高鹽組(salt-sensitivity rats high salt, SHS)和鹽敏感大鼠高鹽補鉀組(salt-sensitivity rats given high salt plus high potassium, SHK)，每組8只，分別攝入低鹽(4 g/kg NaCl)、高鹽(80 g/kg NaCl)及高鹽補鉀(80 g/kg NaCl+80 g/kg KCl)飼料。同樣，6周齡健康雄性SS-13BN大鼠24只，按攝入不同飼料分為鹽不敏感大鼠低鹽組(SS-13BN rats given the low salt, BLS)、鹽不敏感大鼠高鹽組(SS-13BN rats given high salt, BHS)和鹽不敏感大鼠高鹽補鉀組(SS-13BN rats given high salt plus high potassium, BHK)，每組8只。

1.3.2血壓測量 分別在飲食干預前及干預4周末，采用尾袖法測量大鼠尾動脈血壓。測量前1周對大鼠進行固定儀的適應性訓練，每次30 min。測量血壓時，將大鼠固定后置于30 ℃恒溫箱內(nèi)10 min，固定探極，通過對其尾部加壓阻斷其血流，至不能記錄尾部動脈搏動，保持3～5 s，然后打開軟件，逐漸減壓，取尾部出現(xiàn)動脈搏動時血壓為該實驗動物的收縮壓。該系統(tǒng)舒張壓為計算獲得，不作參考。每只大鼠重復測量6次，時間間隔2 min，取均值記錄為最后的血壓值。

1.3.3標本制備 大鼠以100 mL/L水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉后，取腹正中切口，暴露并摘除雙腎，剝離腎纖維膜，一側(cè)腎臟于液氮中速凍保存，另一側(cè)腎臟用100 mL/L甲醛溶液固定制備石蠟標本。

1.3.4RT-PCR法檢測腎髓質(zhì)TGF-β1 mRNA表達 剪取約100 mg的大鼠腎髓質(zhì)組織勻漿提取總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成cDNA，以適量cDNA為模板在TaqDNA聚合酶催化下擴增。TGF-β1引物：上游CTCTGCAGGCGCAGCTCTG，下游：TCAAAAGACAGCCACTCAGG，擴增片段為236 bp；β-actin引物：上游TCAGGTCATCACTATCGGCAAT，下游：AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA，擴增片段為281 bp。擴增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 40 s；退火：52 ℃ 40 s；延伸：72 ℃ 1 min；72 ℃ 5 min，循環(huán)數(shù)為35。以10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Ultro-violet凝膠成像儀分析結(jié)果。

1.3.5免疫組化法檢測腎小管區(qū)TGF-β1蛋白的表達 腎臟常規(guī)石蠟包埋，標本5 μm連續(xù)切片，貼片后于37 ℃溫箱干燥24 h。免疫組化染色步驟：切片脫蠟水化，30 mL/L H2O2-甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶，80 ℃的0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液修復抗原，羊血清封閉，一抗為稀釋后的TGF-β1單克隆抗體(1∶50)，二抗為生物素標記的IgG，滴加辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素，二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽性，采用Image Pro plus軟件半定量分析，每切片選取腎小管區(qū)10個視野，采樣取均值。

1.3.6Masson染色觀察腎小管區(qū)纖維化 腎組織蠟塊連續(xù)5 μm切片，貼片干燥后脫蠟水化，蘇木素、麗春紅酸性品紅、苯胺藍染色。顯微鏡下以藍色膠原沉積為陽性信號，用Image Pro plus軟件進行半定量分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠鈉鉀干預前后血壓的變化各組大鼠基線期血壓差異無統(tǒng)計學意義。Dahl鹽敏感大鼠和SS-13BN大鼠低鹽組、高鹽組、高鹽補鉀組干預后血壓均較基線期升高，高鹽組比低鹽組升高更明顯，高鹽補鉀組血壓較高鹽組降低。干預后高鹽組Dahl鹽敏感大鼠較SS-13BN鹽不敏感大鼠的血壓升高更明顯 (P<0.01， 單因素方差分析)；低鹽組兩種大鼠之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高鹽補鉀組兩種大鼠的血壓差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖1)。

2.2各組大鼠腎髓質(zhì)TGF-β1mRNA表達的變化SHS組TGF-β1 mRNA表達量比SLS組明顯升高(P<0.01)，SHK組TGF-β1 mRNA表達量較SHS組明顯減少(P<0.01)；而BHS組TGF-β1 mRNA表達較BLS組也有所升高(P<0.05)，程度較輕，BHK組較BHS組有所減少(P<0.05)。低鹽組、高鹽組SS-13BN鹽不敏感大鼠較Dahl鹽敏感大鼠TGF-β1 mRNA表達減少(圖2)。

圖1 各組大鼠飲食干預前后血壓的變化

圖2 各組大鼠腎髓質(zhì)TGF-β1 mRNA表達的變化

2.3各組大鼠腎小管區(qū)TGF-β1蛋白表達的變化Dahl鹽敏感大鼠腎小管上皮細胞表達的TGF-β1，SHS組明顯多于SLS組(P<0.01)，SHK組較SHS組明顯減少(P<0.01)。SS-13BN大鼠3組腎小管上皮所表達的TGF-β1差別比Dahl大鼠小，其中BHK組較BHS組表達明顯減少(P<0.01)。高鹽組、高鹽補鉀組SS-13BN鹽不敏感大鼠較Dahl鹽敏感大鼠TGF-β1蛋白表達減少(圖3)。

2.4各組大鼠腎小管區(qū)形態(tài)學的變化Dahl鹽敏感大鼠腎小管區(qū)膠原沉積，SHS組明顯多于SLS組(P<0.01)，SHK組則較SHS組明顯減少(P<0.01)。而鹽不敏感大鼠3組腎小管膠原沉積差異無統(tǒng)計學意義。高鹽組、高鹽補鉀組SS-13BN鹽不敏感大鼠較Dahl鹽敏感大鼠腎小管膠原沉積減少(圖4)。

圖3 各組大鼠腎小管區(qū)TGF-β1的免疫組化染色Fig.3 Immunohistochemisty of TGF-β1 in renal tu-bules of different groups of ratsA:腎髓質(zhì)TGF-β1免疫組化染色(×200);A1:SLS;A2:SHS;A3:SHK;A4:BLS;A5:BHS;A6:BHK。B:腎髓質(zhì)TGF-β1表達的平均吸光度比較。

3討論

本研究結(jié)果顯示，鹽負荷飲食可誘導Dahl鹽敏感大鼠血壓升高，而SS-13BN大鼠的血壓升高幅度較小，提示鹽可以促進鹽敏感大鼠形成高血壓；此外，高鹽負荷使鹽敏感大鼠腎髓質(zhì)TGF-β1 mRNA和蛋白表達水平明顯升高，而SS-13BN大鼠腎臟髓質(zhì)TGF-β1表達對鹽反應遲鈍，雖有升高趨勢，但不如鹽敏感大鼠明顯，提示高鹽促進鹽敏感大鼠腎臟損傷，其可能是通過增加TGF-β1表達而實現(xiàn)的。

鹽敏感高血壓的形成與腎臟功能障礙有著錯綜復雜的關系，TGF-β1在其中可能起著重要作用[5]。TGF-β是一種具有激素活性的多肽，會影響靶細胞的增殖、修復、分化、凋亡、免疫功能等。晚近研究結(jié)果顯示，TGF-β1依賴的通路在高血壓腎臟損害過程中起著非常重要的作用，與系膜基質(zhì)增生和間質(zhì)纖維化密切相關[6]。高血壓腎損害中，TGF-β1過表達，增加細胞外基質(zhì)合成，減少各種酶的表達，促進各種酶激活物的抑制物表達，使細胞外基質(zhì)降解減少，同時刺激系膜細胞增殖，并增加基質(zhì)蛋白受體表達，促進細胞與基質(zhì)之間相互作用；也作用于各種炎癥細胞，促進多種細胞因子表達[7-8]。此外，TGF-β1能與腎素-血管緊張素系統(tǒng)相互調(diào)節(jié)，研究表明，TGF-β1能刺激腎小球旁細胞釋放腎素，激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)，促使血壓升高[9]。體內(nèi)外研究均表明，對大鼠的腎小球系膜細胞，血管緊張素II是呈劑量依賴、時間依賴地增加TGF-βl mRNA的表達和促進TGF-βl的活化，并伴有細胞外基質(zhì)成分及其mRNA表達的增加，最終導致腎纖維化的發(fā)生[10]。也有研究證明，氧化應激與TGF-β1的產(chǎn)生關系密切，TGF-β1促進腎組織中過氧化物的釋放，可能是通過還原型輔酶Ⅱ介導的，而過氧化物也可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路促進TGF-β1的表達[8]。DAHLY等[11]研究發(fā)現(xiàn)，給Dahl鹽敏感大鼠TGF-β1抗體治療后，腎臟TGF-β1 mRNA及蛋白的表達，可降低高鹽飲食后升高的血壓及減輕心臟、腎臟等靶器官功能障礙，這恰證實TGF-β產(chǎn)物可增加Dahl鹽敏感大鼠腎小球和缺氧性腎小管細胞的損傷。

圖4 各組大鼠腎小管區(qū)Masson染色的膠原容積分數(shù)Fig.4 Masson staining of collagen volume fraction in renal tubular areaA:大鼠腎小管區(qū)Masson染色(×200);A1:SLS;A2:SHS;A3:SHK;A4:BLS;A5:BHS;A6:BHK。B:大鼠腎小管區(qū)Masson染色膠原容積分數(shù)的比較。

早期實驗顯示，增加鹽的攝入也會導致主動脈環(huán)TGF-β1表達增加，內(nèi)皮細胞是鹽的直接作用環(huán)節(jié)[12]。INOUE等[13]研究發(fā)現(xiàn)，主動脈血管內(nèi)皮細胞予TGF-β1培養(yǎng)后一氧化氮合酶轉(zhuǎn)錄增多，一氧化氮產(chǎn)物生成增加。SANDERS等[14]也證明正常血壓大鼠或鹽不敏感大鼠給予鹽攝入后一氧化氮增加，反饋抑制TGF-β1，進一步舒張血管，減弱剪切力。而Dahl鹽敏感大鼠并非如此，其一氧化氮產(chǎn)物生成減少，對TGF-β1的反饋作用減弱，導致鹽敏感大鼠進展性腎功能不全。此外研究還表明，對SD大鼠高鹽干預，靜注四乙銨，組織內(nèi)TGF-β1與一氧化氮合酶的表達均被抑制，且內(nèi)皮細胞中MAPK信號通路的活性亦明顯受抑；而抑制MAPK信號通路后也可降低TGF-β1與一氧化氮合酶表達[15]。

本研究在高鹽飲食的基礎上補充鉀攝入，結(jié)果顯示，Dahl鹽敏感組在高鹽攝入的基礎上大劑量補鉀不僅使血壓顯著下降，而且能使腎髓質(zhì)TGF-β1表達明顯減少；無論是鹽敏感組還是鹽不敏感組大鼠，補鉀均可使高鹽負荷升高的血壓和TGF-β1 mRNA及蛋白表達水平下降。提示大劑量補鉀可能通過TGF-β1依賴性通路發(fā)揮血壓保護作用。此外，Dahl鹽敏感大鼠補鉀后血壓顯著降低，而SS-13BN大鼠血壓較高鹽組也稍有降低。由此可知，根據(jù)大鼠遺傳基因不同，血壓對鹽的敏感性不同，對鉀的反應也有差別。

鉀與鈉離子的相互拮抗可調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，對過多鈉鹽攝入所引起的靶器官損害有一定程度的保護作用。KIDO等[16-17]對4周齡的SD大鼠分別給予低鹽(4 g/L NaCl)、高鹽(80 g/L NaCl)和高鹽加補鉀(80 g/L KCl)飲食，研究發(fā)現(xiàn)，補鉀可以減輕鹽誘導的血管內(nèi)膜增生、巨噬細胞浸潤，并且可以抑制超氧化物表達，抑制NADPH氧化酶減少活性氧的生成，從而發(fā)揮抗氧化效應和心血管保護作用。WANG等[18]在慢性腎病模型的SD大鼠中研究發(fā)現(xiàn)，補鉀可以通過降低巨噬細胞的浸潤、炎癥因子的表達以及核因子-KB的激活從而減輕腎臟的炎性損傷；進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些作用與TGF-β的下調(diào)及Smad7的上調(diào)有關。YING等[19]則發(fā)現(xiàn)，補鉀可抑制高鹽誘導的內(nèi)皮細胞上鈣激活的鉀通道從而抑制TGF-β1的表達而發(fā)揮對靶器官的保護作用。有關補鉀對腎髓質(zhì)TGF-β1表達水平影響的具體機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 劉治全，牟建軍，李玉明，等. 鹽與高血壓[M]. 北京：北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社, 1997.

[2] 王文，顧東風，陳偉偉. 鹽與高血壓[M]. 北京：衛(wèi)生部疾病預防控制局, 2009.

[3] ZHOU XJ, RAKHEJA D, YU X, et al. The aging kidney[J]. Kid Inter, 2008, 74(6):710-720.

[4] MU JJ, LIU ZQ, LIU FQ, et al. Family based randomized trial to detect effects on blood pressure of a salt substitute containing potassium and calcium in hypertensive adolescents[J]. AMJ Hypertens, 2009, 22(9):943-947.

[5] YU H, BURRELL LM, BLACK MJ, et al. Salt induces myocardial and renal fibrosis in normotensive and hypertensive rats[J]. Circulation, 1998, 98(23):2621-2628.

[6] THIERY JP, ACLOQUE H, HUANG RYJ, et al. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J]. Cell, 2009, 139(5):871-890.

[7] KALLURI R, WEINBERG RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition[J]. J Clin Invest, 2009, 119(6):1420.

[8] AUGUST P, SUTHANTHIRAN M. Transforming growth factor beta and progression of renal disease[J]. Kid Inter, 2003,11(87):S99-S104.

[9] KAGAMI S, BORDER WA, MILLER DE, et al. Angiotensin II stimulates extracellular matrix protein synthesis through induction of transforming growth factor-beta expression in rat glomerular mesangial cells[J]. J Clin Invest, 1994, 93(6):2431.

[10] 姚頤，張杰. 腎間質(zhì)纖維化相關信號轉(zhuǎn)導通路的研究進展[J]. 國際泌尿系統(tǒng)雜志, 2007, 27(6):831-834.

[11] DAHLY AJ, HOAGLAND KM, FLASCH AK, et al. Antihypertensive effects of chronic anti-TGF-β antibody therapy in Dahl S rats[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2002, 283(3):R757-R767.

[12] YING WZ, KRISTAL A, PAUL W. Mechanism of dietary salt-mediated increase in intravascular production of TGF-β1[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2008, 295:F406-F414.

[13] YING WZ, SANDERS PW. Dietary salt increases endothelial nitric oxide synthase and TGF-β1 in rat aortic endothelium[J]. Am J Physiol, 1999, 277(4 Pt 2):H1293-H1298.

[14] SANDERS PW. Vascular consequences of dietary salt intake[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2009, 297(2):F237-F243.

[15] SANDERS PW. Dietary salt intake, salt sensitivity, and cardiovascular health[J]. Hypertension, 2009, 53(3):442-445.

[16] KIDO M, ANDO K, ONOZATO ML, et al. Protective effect of dietary potassium against vascular injury in salt-sensitive hypertension[J]. Hypertension, 2008, 51(2):225-231.

[17] OBERLEITHNER H, CALLIES C, KUSCHE-VIHROG K, et al. Potassium softens vascular endothelium and increases nitric oxide release[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(8):2829.

[18] WANG W, SOLTERO L, ZHANG P, et al. Renal inflammation is modulated by potassium in chronic kidney disease: possible role of Smad7[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 293(4):F1123-F1130.

[19] YING WZ, AARON K, WANG PX, et al. Potassium inhibits dietary salt-induced transforming growth factor-β production[J]. Hypertension, 2009, 54(5):1159-1163.