微波輔助雙水相提取苦蕎麥粉中黃酮類化合物

徐春明, 李　婷, 王英英, 龐高陽, 劉　穎

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心/北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

蕎麥(Fagopyrum esculentum Moench)為木蘭綱(magnoliopsida)蓼目(polygonales)蓼科(polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)雙子葉藥食兩用作物.蕎麥主要有兩個(gè)栽培種,分別為韃靼蕎麥(苦蕎)(Fagopyrum tataricum(Linn.)Gaertn.)和普通蕎麥(甜蕎)(Fagopyrum esculentum Moench).我國蕎麥分布較廣,華北、西北、東北地區(qū)多種植甜蕎,而西南地區(qū)的四川、云南、貴州等省則多種植苦蕎[1].苦蕎麥比小麥、稻米等谷物含有更豐富的黃酮、膳食纖維、維生素及礦物質(zhì)等對人體有益的物質(zhì)[2].苦蕎麥的籽粒、根莖葉及花都含有黃酮類物質(zhì),這些黃酮類物質(zhì)的主要成分為蘆丁,占總黃酮的70% ～80%[3].黃酮類化合物在降血糖、抑菌抗炎癥、治療心血管疾病、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面都有明顯作用[4-5].從苦蕎麥中提取黃酮類化合物的傳統(tǒng)提取方法有醇類提取、熱水提取、堿提取、柱層析及其他溶液提取法.微波輔助提取法近年來廣泛應(yīng)用于天然活性成分的提取,可提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率,從而提高提取產(chǎn)率[6];基于乙醇、異丙醇等有機(jī)物與無機(jī)鹽形成的新型雙水相體系與傳統(tǒng)的雙水相體系,即高分子聚合物/鹽體系相比,成本更低,萃取相不含黏度大、難處理的聚合物,且表現(xiàn)出良好的分離性能[7-8].本實(shí)驗(yàn)研究乙醇-硫酸銨雙水相提取苦蕎麥粉中黃酮類化合物的提取條件(確定較優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)以及硫酸銨添加量);通過單因素實(shí)驗(yàn)初步優(yōu)化苦蕎麥粉中黃酮類化合物的提取條件,并利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化微波輔助雙水相提取苦蕎麥粉黃酮類化合物的提取條件.

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

苦蕎麥粉,在北京永輝超市購得苦蕎麥,用粉碎機(jī)粉碎并過40目篩制得;無水乙醇,分析醇,北京化工廠;硫酸銨,分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,色譜純,生工生物有限公司;氫氧化鈉,分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;亞硝酸鈉,分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;水合硝酸鋁,分析純,北京市匯?？苾x科技有限公司.

1.2　儀器與設(shè)備

AL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;NC28105型微波萃取儀,Cemcorporation公司,SB25-120型超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;D-37520型離心機(jī),Sigma laborzentrifugen公司;TD5A型離心機(jī),湖南赫西儀器裝備有限公司;SpectraMAX190型酶標(biāo)儀,Molecular Devices;FW400A型萬能粉碎機(jī),北京中興偉業(yè)有限公司;HH-4型水浴鍋,華港通國際有限公司;Eppendorf 96孔板,Eppendorf中國有限公司.

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1提取黃酮類化合物

參考文獻(xiàn)[9],提取苦蕎麥粉中黃酮類化合物.將過40目篩的苦蕎麥粉,放入烘箱中,溫度恒定為60℃,烘干,待物料恒重后取出,密封袋包裝好,稱重,備用.準(zhǔn)確稱取5.00 g苦蕎麥粉于200 mL溶劑中,首先靜置約10 min,目的是為了讓苦蕎麥粉在微波前更好的浸透于溶劑中,從而提高微波提取效率.后進(jìn)行微波輔助提取,提取結(jié)束后進(jìn)行離心5 000 r/min,15 min,后取上清液,加入硫酸銨,靜置,分相.上層液體為乙醇相.將兩相分離,將上層液體進(jìn)行離心,5 000 r/min,5 min,取上清液,妥善保存,待測.最后測上清液黃酮含量,取上清液2 mL于10 mL容量瓶,定容,搖勻,用96孔板測其吸光度,并對照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮類化合物含量及其提取率,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.2總黃酮含量測定

準(zhǔn)確稱取0.10 g蘆丁,置500 mL燒杯中,加入乙醇溶解,后轉(zhuǎn)移置500 mL容量瓶中,定容,制得質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液.用移液管準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL分別置于10 mL容量瓶中,分別加乙醇溶液至3.0 mL,加ω(NaNO2)為5%的水溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,加 ω(Al(NO)3)為10%的水溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min,最后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,再加入φ(乙醇)30%的溶液定容至刻度線,搖勻,放置15 min,在510 nm波長處測定吸光度.以吸光度為縱坐標(biāo);蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),mg/L,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1.

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin

計(jì)算回歸方程為y=0.004 2x-0.002 9(R2=0.998 7),確定了0～60 mg/L蘆丁吸光度與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系.

1.3.3雙水相體系的確定及單因素實(shí)驗(yàn)

確定苦蕎麥粉中黃酮類化合物提取的較優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)以及硫酸銨添加量.以微波提取時(shí)間、微波提取功率、料液比為因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各個(gè)因素分別對苦蕎麥粉黃酮得率的影響.

1.3.4Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,確定自變量,以苦蕎麥粉總黃酮得率為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面分析法安排實(shí)驗(yàn)以獲取較佳提取條件,并用Design-Expert 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2　結(jié)果與討論

2.1　苦蕎麥粉黃酮類化合物提取的較優(yōu)乙醇體積分?jǐn)?shù)以及硫酸銨添加量

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)研究表明乙醇-硫酸銨雙水相在乙醇體積分?jǐn)?shù)為18%～55%范圍內(nèi),添加適量硫酸銨時(shí)乙醇-硫酸銨可以分成兩相.本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行乙醇-硫酸銨較優(yōu)配比的探究.在分成兩相的乙醇體積分?jǐn)?shù)區(qū)間取整數(shù)體積比以方便實(shí)驗(yàn)研究,因此乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為20%～50%,取體積分?jǐn)?shù)20%,30%,40%,50%,硫酸銨以0.1 g/mL作為最小單位分組,共分為6組,0.2～0.7 g/mL.根據(jù)上述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),所得雙水相上層液體體積與乙醇的體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨添加量關(guān)系如表1.

表1　乙醇體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨添加量對雙水相上層液體體積的影響Tab.1　Effect of ammonium sulfate dosage and alcohol concen-tration on top phase volume of aqueous two-phase___

從表1可得,乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí),硫酸銨添加量為0.3～0.5 g/mL時(shí),上層液體體積近似于溶液中的乙醇體積,列入以下實(shí)驗(yàn)考慮中,而硫酸銨的添加量需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定.乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%和50%時(shí),恰恰與20%乙醇雙水相呈現(xiàn)相反現(xiàn)象,綜合考察雙水相系線原則、萃取時(shí)操作方便、萃取率等因素[10],確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí),萃取效果較佳,且理想硫酸銨添加量考慮范圍為0.3～0.5 g/mL.

2.1.2最佳硫酸銨濃度的確定

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,乙醇體積分?jǐn)?shù)選定為30%,硫酸銨添加范圍為0.3～0.5 g/mL,以0.02 g/mL作為最小單位,進(jìn)行細(xì)化實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖2.

圖2　硫酸銨添加量對30%乙醇上層液體體積的影響Fig.2　Effect of ammonium sulfate dosage on top phase volume of aqueous two-phase including 30%ethanol

從圖2可得,當(dāng)硫酸銨添加量在0.38～0.39 g/mL與添加量在0.42～0.44 g/mL時(shí)最接近雙水相中真實(shí)乙醇含量.

2.2　苦蕎麥粉中黃酮類化合物提取的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1微波提取時(shí)間對黃酮提取率的影響

在其他因素相同的條件下,改變微波提取時(shí)間,考察其對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響.雙水相體系溶劑為φ(乙醇)30%,苦蕎麥粉在提取溶劑中的質(zhì)量濃度0.025 g/mL,微波功率500 W,微波時(shí)間為30～150 s(以30 s為一個(gè)單位),最高溫度65℃(溫度過高時(shí),儀器自動降低微波功率,使之不超過設(shè)置值)的條件下,進(jìn)行微波輔助提取操作,后添加0.38 g/mL硫酸銨溶液進(jìn)行分相,最后計(jì)算苦蕎麥粉的黃酮得率,如圖3.

圖3　微波時(shí)間對黃酮得率的影響Fig.3　Effect of microwave time on extraction yield of total flavonoids

從圖3可知,苦蕎麥麥粉微波時(shí)間在50～70 s有一個(gè)峰值,并且峰值靠近60 s數(shù)據(jù)點(diǎn),而對于K值最大點(diǎn),考慮最大得率和最經(jīng)濟(jì)兩種情況兼顧,故在以下細(xì)化實(shí)驗(yàn)中,微波時(shí)間的考慮范圍均為40～80 s.

2.2.2微波功率對黃酮提取率的影響

雙水相體系,溶劑為30%乙醇,苦蕎麥粉在提取溶劑中的質(zhì)量濃度0.025 g/mL,微波功率分別為,300～700 W(每100 W為一個(gè)單位)微波提取時(shí)間80 s,最高溫度65℃的條件下,進(jìn)行微波輔助萃取操作,然后添加硫酸銨進(jìn)行分相,最后用酶標(biāo)儀測吸光度,計(jì)算黃酮得率,數(shù)據(jù)如圖4.

圖4　微波功率對黃酮得率的影響Fig.4　Effect of microwave power on the extraction yield of total flavonoids

由圖4可知,微波功率對于苦蕎麥麥粉的影響較大,微波功率在500～600 W有一個(gè)峰值,并且峰值靠近500 W數(shù)據(jù)點(diǎn),而且經(jīng)過500 W這個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)后,苦蕎麥黃酮的得率有明顯下降,微波功率從400～500 W,總黃酮得率有明顯的升高,在進(jìn)一步的細(xì)化實(shí)驗(yàn)中,微波功率選擇從450～550 W.

2.2.3料液比對黃酮提取率的影響

雙水相體系,溶劑為30%乙醇,料液比(苦蕎麥粉的質(zhì)量與作為浸提液溶劑的體積比,g/mL)從1∶30到1∶70,微波功率為 500 W,微波時(shí)間 60 s,最高溫度65℃的條件下進(jìn)行微波輔助提取,后添加硫酸銨進(jìn)行分相,最后用酶標(biāo)儀測吸光度并計(jì)算黃酮得率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5.

從圖5可以看出針對苦蕎麥粉中提取苦蕎麥黃酮得率最高點(diǎn)位于料液比1∶60(g/mL)數(shù)據(jù)點(diǎn)左右,當(dāng)料液比超過1∶50(g/mL)后,苦蕎麥黃酮的得率變化不大,而當(dāng)料液比高于1∶70(g/mL)時(shí),提取就會變得相對不經(jīng)濟(jì).針對這種情況,考察酶標(biāo)儀測得的苦蕎麥粉提取黃酮類化合物吸光度與料液比之間的關(guān)系,并作圖6.

圖5　料液比對黃酮得率的影響Fig.5　Effect of material-to-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

圖6 料液比對吸光度的影響Fig.6　Effect of material-to-liquid ratio on absorbance

圖6表明,當(dāng)料液比從 1∶30 ～1∶50(g/mL)時(shí),溶劑利用度較高,而考慮到當(dāng)料液比為1∶50～1∶60(g/mL)時(shí)得率最高,為避免資源浪費(fèi),在后續(xù)細(xì)化實(shí)驗(yàn)中料液比擬定為1∶30～1∶50(g/mL).

2.3　苦蕎麥粉黃酮提取的響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田志芳一個(gè)人在地窩子里，看看頭頂，看看腳下，一屁股坐在土臺上，嘆口氣，心想姆媽拼死阻攔都沒攔住她和哥哥，現(xiàn)在怪誰呢，自己跳起腳要支邊。她垂下頭，把手中的沙棗花捧起來瞧，帶沙點(diǎn)的葉根處，確實(shí)有細(xì)小的花苞，同樣泛出密密麻麻的沙塵，形如青色的米粒，一粒一粒擠在一起，好似家鄉(xiāng)中秋的桂花。猜想，沙棗花開了，是不是真有桂花那樣的千里香？

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇微波功率(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析,確定苦蕎麥粉黃酮提取的較優(yōu)條件,試驗(yàn)因素水平組合見表2,Box-Behnken設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3和表4.

表2　響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Tab.2　Factors and levels of response surface analysis

表3　Box-Behnken設(shè)計(jì)和結(jié)果Tab.3　Box-Behnken design and results

采用Design-Expert 7軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到苦蕎麥粉黃酮提取率對A微波功率(W)、B提取時(shí)間(s)、C料液比(g/mL)的二次多項(xiàng)回歸方程為:

表4　回歸模型的方差分析Tab.4　Variance analysis for established regression model

如表4,通過方差分析,回歸模型極顯著分析,除了AB和BC交互項(xiàng)之外,其他各項(xiàng)對結(jié)果的影響均達(dá)到顯著水平,失擬值不顯著,模型的 R2=0.969 3說明模型與實(shí)際的試驗(yàn)結(jié)果的擬合程度較好,可以用此模型對苦蕎麥粉中的黃酮提取率進(jìn)行預(yù)測.

2.3.2響應(yīng)面分析

對微波功率、提取時(shí)間、料液比三因素交互作用,做響應(yīng)曲面圖,見圖7.

圖7　各因素交互作用對總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.7　Response surface plots and contour plots showing effects of pairwise interactions of factors on extraction yield of total flavonoids

從圖7中可以看出,微波提取時(shí)間與料液比相互作用對苦蕎麥粉黃酮提取率的影響不明顯,等勢面接近于圓形,微波提取時(shí)間與微波功率相互作用對苦蕎麥粉黃酮提取率的影響也不明顯,等勢面亦接近于圓形,而料液比與微波功率相互作用對苦蕎麥粉黃酮提取率的影響十分明顯,等勢面是明顯的橢圓形.根據(jù)回歸方程及上述分析,響應(yīng)面存在最大值,解方程可得苦蕎麥粉中黃酮的較優(yōu)提取條件為微波功率534.73 W,處理時(shí)間為71.34 s,料液比為1∶48.79(g/mL),理論最大萃取得率為14.18 mg/g.考慮實(shí)際操作,取微波功率550 W,處理時(shí)間為70 s,料液比為1∶50(g/mL),三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值為13.82 mg/g,基本與預(yù)測值相近.由此可見,該模型能夠較為準(zhǔn)確地反映出三種因素對于苦蕎麥粉中的黃酮提取率的影響.

3　結(jié) 論

利用乙醇-硫酸銨雙水相微波輔助提取苦蕎麥粉中黃酮類化合物的較優(yōu)條件為萃取劑是體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液,微波功率550 W,微波提取時(shí)間70 s,料液比為1∶50(g/mL),苦蕎麥粉中黃酮類化合物提取率為13.82 mg/g.而苦蕎麥粉中苦蕎麥黃酮含量約占總重量的2.31%[11],利用乙醇-硫酸銨雙水相微波輔助提取苦蕎麥粉中黃酮的得率約為1.38%,占總黃酮量的59.7%,得率較高,操作不復(fù)雜,用時(shí)較短,具有較強(qiáng)的可操作性.由此可得乙醇-硫酸銨雙水相微波輔助提取適合于苦蕎麥粉中黃酮類化合物的提取.