亞硝酸鹽對蝦類毒性影響的研究進展

寇紅巖,冼健安,郭 慧,錢 坤,苗玉濤,葉超霞,潘訓彬,王安利

(華南師范大學 生命科學學院,廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室,生態(tài)與環(huán)境科學廣東普通高校重點實驗室,廣東 廣州 510631)

1 水體亞硝酸鹽的來源

亞硝酸鹽是水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中最常見的污染物之一。蝦類主要以氨的形式進行氮廢物的排泄,亞硝酸鹽是由氨轉(zhuǎn)變而來的,這過程由亞硝化細菌所完成。硝化細菌可進一步將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁},可見亞硝酸鹽是養(yǎng)殖水體中脫氮作用的中間產(chǎn)物,但由于硝化細菌的生長速度較亞硝化細菌慢很多,這一轉(zhuǎn)變過程容易失衡,亞硝酸鹽就被積累在養(yǎng)殖水體中[1]。因此隨著養(yǎng)殖周期的延長,亞硝酸鹽的濃度也會越來越高。在高密度對蝦養(yǎng)殖池中,亞硝酸氮的質(zhì)量濃度可達到20 mg/L[2]。

2 亞硝酸氮對蝦類的半致死濃度

2.1 亞硝酸氮對不同蝦種的半致死濃度

多種蝦類的亞硝酸氮對不同蝦種的半致死濃度(median lethal concentration,LC50)已有研究報道,結(jié)果見表1。對于同種蝦類,不同學者的研究結(jié)果有一定的差異,可能是由于影響亞硝酸氮毒性的因素較多,不同研究條件有一定的差異所致。但總體上看,海水蝦類比淡水蝦類的亞硝酸氮耐受能力要高得多,主要與水體的鹽度有關(guān)。

2.2 亞硝酸氮對不同蝦齡的半致死濃度

斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)[3]和長毛對蝦(P.penicillatus)[4]的研究結(jié)果顯示,各時期幼蟲的亞硝酸鹽耐受能力依次為: 仔蝦>糠蝦>溞狀幼蟲>無節(jié)幼蟲。在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的研究中,仔蝦的 24h耐受力不如糠蝦和溞狀幼體,但仔蝦的96 h耐受力則遠高于糠蝦和溞狀幼體[5]。對于日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus),溞狀幼體的 24 h耐受力高于糠蝦和仔蝦,但96h時仔蝦的耐受力最高[5]。刀額新對蝦(Metapenaeus ensis)則表現(xiàn)為: 仔蝦>糠蝦>無節(jié)幼蟲>溞狀幼蟲[6]。對于不同蝦齡的成體,目前仍缺乏系統(tǒng)的比較研究,而不同學者研究的條件也存在一定的差異,較難進行準確的比較。

2.3 影響亞硝酸鹽毒性的環(huán)境因素

目前研究結(jié)果顯示,影響亞硝酸鹽毒性的環(huán)境因素主要有鹽度、Cl-含量、溶氧和 pH等。鹽度對亞硝酸鹽毒性的影響十分顯著,鹽度越高,蝦類對亞硝酸鹽的耐受能力就越強[7-9]。鹽度影響其毒性可能主要與 Cl-含量有關(guān),主要與 Cl-競爭鰓上的吸收位點,鹽度越高,Cl-的含量就越高,競爭吸收進入體內(nèi)的就越少。研究證實水環(huán)境中Cl-含量越高,蝦類對亞硝酸鹽的耐受能力也越強[10-12]。研究表明水體溶氧量越高,亞硝酸鹽的毒性越低[13-14]。破壞蝦類血藍蛋白的正常攜氧能力,導致機體缺氧是亞硝酸鹽的毒性機制之一[15-18],因此水體溶氧量的提高可緩解亞硝酸鹽的毒性作用。在水環(huán)境中,亞硝酸鹽以亞硝酸根離子()和亞硝酸(HNO2)兩種形式存在,后者能自由擴散通過鰓進入機體,毒性較大。在天然水體pH條件下,只有很少一部分亞硝酸鹽以HNO2的形式存在,當水體pH下降時,以HNO2形式存在的亞硝酸鹽的比例上升,因此在低pH條件下,亞硝酸鹽的毒性較強。在pH為6.8、8.2和9.8的水體中,斑節(jié)對蝦經(jīng)0.72 mmol/L亞硝酸鹽脅迫48 h后,血淋巴的亞硝酸鹽濃度分別上升至3.70、2.87和1.91 μmol/L[19]。溫度也是十分重要的環(huán)境因子,但目前仍未見關(guān)于溫度影響亞硝酸鹽對蝦類的毒性的研究報道。

在實際養(yǎng)殖過程中,亞硝酸鹽并不是單一存在的,氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮可相互轉(zhuǎn)化,各組分的比例會受到環(huán)境因子(溶氧、pH、鹽度等)的影響,主要是由于這些環(huán)境因子改變了硝化或反硝化的方向和速率[20-22]。另外,養(yǎng)殖模式也會影響總氮和亞硝酸氮的含量[23]。因此,在池塘養(yǎng)殖中,亞硝酸鹽毒性的影響因素和過程要復雜得多。

表1 亞硝酸氮對不同蝦類的半致死濃度(LC50,mg/L)

續(xù)表

3 亞硝酸鹽的吸收和積累

圖1 亞硝酸鹽對蝦類血淋巴的影響

亞硝酸鹽進入血淋巴后,被運送到其他組織,并有不同程度的積累。斑節(jié)對蝦暴露于0.36 mmol/L的-N中48h后,肌肉、肝胰腺、鰓、前腸、血淋巴、心臟、眼柄和中腸的-N濃度分別上升至外環(huán)境濃度的 1.1、3.4、5.0、5.6、6.6、6.8、8.5和11.4倍,此研究結(jié)果顯示肌肉基本不積累-N,而中腸積累的-N最多[42]。海水魚類除通過鰓吸收亞硝酸鹽外,還可以通過腸道進行吸收[1],斑節(jié)對蝦的中腸是積累-N最多的組織,可能意味著海水蝦類也有著相同的吸收機制,即在吞飲水的同時可能通過中腸吸收亞硝酸鹽。

4 亞硝酸鹽對蝦類的毒性影響

4.1 對蝦類生長和變態(tài)的影響

一定濃度的亞硝酸鹽會抑制蝦類的生長和變態(tài)發(fā)育。凡納濱對蝦置于(2.5～5.0)mg/L-N中養(yǎng)殖14 d,其體長、體質(zhì)量增長率和存活率均低于對照組[25]。羅氏沼蝦幼體經(jīng)-N亞急性毒性作用,出現(xiàn)發(fā)育變態(tài)緩慢,增質(zhì)量率和存活率下降等現(xiàn)象[33,43]。因此,控制水體中亞硝酸鹽濃度對蝦類健康苗種的培育至關(guān)重要的一環(huán)[44-45]。

4.2 對蝦類組織結(jié)構(gòu)的影響

血淋巴是蝦體積累亞硝酸鹽的主要部位之一,如前所示,血漿中的-N濃度可以累積達到外環(huán)境的6.6倍,因此在亞硝酸鹽脅迫過程中,血細胞將遭受胞外高濃度-N的刺激。羅氏沼蝦經(jīng)-N應激后,血細胞總數(shù)(Total haemocyte count,THC)不斷下降,血細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示透明細胞出現(xiàn)核變小,常染色質(zhì)、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和線粒體數(shù)量減少等現(xiàn)象,而半顆粒細胞和顆粒細胞除出現(xiàn)上述現(xiàn)象外,細胞質(zhì)中的高電子致密顆粒數(shù)量也減少[46],這些結(jié)果表明-N導致了血細胞結(jié)構(gòu)異常,這將進一步導致各種生理和免疫功能的異常。

4.3 對蝦類血藍蛋白及其載氧能力的影響

亞硝酸鹽對血藍蛋白載氧能力的破壞被認為是其對蝦類產(chǎn)生毒性的主要機制之一。眾多研究顯示,蝦類受到亞硝酸鹽脅迫后,隨著血淋巴亞硝酸鹽濃度的上升,氧合血藍蛋白和血清總蛋白含量、氧合血藍蛋白占血清總蛋白含量的比例、血淋巴的氧親和力均顯著下降[15-18]。血藍蛋白是甲殼動物機體內(nèi)的載氧蛋白,亞硝酸鹽進入血淋巴后,導致氧合血藍蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跹{蛋白,并抑制脫氧血藍蛋白與氧結(jié)合[15];另一方面,與亞硝酸鹽破壞血紅蛋白的機制類似,亞硝酸鹽可能進一步導致脫氧血藍蛋白氧化為變性血藍蛋白,研究發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽與脫氧血藍蛋白的反應速率比其與氧合血藍蛋白的反應速率快15倍[49]。因此,亞硝酸鹽導致血淋巴的氧親和力下降,破壞了其正常的攜氧能力,最終導致蝦類窒息死亡[15](圖1)。

4.4 對蝦類血淋巴生化組成和生理狀態(tài)的影響

4.4.1 離子含量

正常狀態(tài)下,鰓細胞中 Cl-的流入和的排出調(diào)節(jié)了Cl-轉(zhuǎn)運和血淋巴的酸堿平衡。亞硝酸鹽脅迫下,在 Cl-/交換過程中,由于的競爭,部分Cl-被替代,進入蝦體的Cl-減少。小龍蝦暴露于1 mmol/L亞硝酸鹽1周后,血淋巴的Cl-含量下降了40%[41]。日本對蝦暴露于0.36 mmol/L亞硝酸鹽24 h后,血淋巴Cl-減少了58 mmol/L[50]。亞硝酸鹽脅迫下,血淋巴中的也會下降[51],一方面可能由于與進行交換而排出體外,另一方面有研究者認為與氨通過鳥氨酸循環(huán)合成了尿素[52](圖1)。

日本囊對蝦的研究顯示,亞硝酸鹽脅迫對血淋巴中 K+、Ca2+和 Mg2+的含量沒有顯著影響,而 Na+含量則顯著下降,作者認為 Na+含量的下降可能是蝦體水分含量上升所致[50]。小龍蝦的研究也發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽脅迫導致血淋巴 Na+含量下降,另外還發(fā)現(xiàn)其肌肉的 K+含量大大下降,而在中腸腺則有升高的趨勢,肌肉流失的部分 K+可能轉(zhuǎn)移到了中腸腺內(nèi)[53]。羅氏沼蝦在低Cl-含量的水體中受到亞硝酸鹽脅迫時,血淋巴的Na+、K+和Mg2+的含量均有顯著下降[10]。

4.4.2 蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量

蝦類血淋巴中含有大量的蛋白質(zhì),其中80%～95%為血藍蛋白[15],剩下的部分主要是與免疫和凝集相關(guān)的因子,如酚氧化酶、凝集素、β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白和抗菌肽等。血清總蛋白含量在亞硝酸鹽脅迫下呈現(xiàn)顯著的下降[15,17,50],其下降一方面可能由于部分蛋白質(zhì)被加速代謝為氨氮;另一方面,在亞硝酸鹽脅迫下,血清中多種免疫酶類的活性下降[27],血細胞產(chǎn)生各類功能蛋白的能力可能受到了抑制。與總蛋白含量的變化相同,血清游離氨基酸含量也呈現(xiàn)下降現(xiàn)象,另外還伴隨著氨氮排泄量的顯著上升[50](圖 1),表明其下降可能是代謝速度加快所致。

4.4.3 氮代謝

在亞硝酸鹽脅迫下,蝦類的總氮、氨氮、尿素氮和有機氮的排泄量均顯著提高[52,54]。日本對蝦經(jīng)0.076和1.433 mmol/L亞硝酸鹽脅迫48 h后,其氨氮的排泄量分別是對照組對蝦的1.7和2.9倍,尿素氮的排泄量分別是對照組對蝦的263和694倍,有機氮的排泄量分別是對照組對蝦的49和832倍[52]。這些結(jié)果表明,亞硝酸鹽脅迫導致蝦體的生理代謝過程加快。

研究表明,在十足目甲殼動物的氮排泄物中,氨氮占 60%～70%,氨基酸占 10%,另外還有少量的尿素、尿酸和氧化三甲胺[55]。亞硝酸脅迫下,氮代謝途徑也發(fā)生了改變。日本對蝦在正常生理狀態(tài)下,氨氮和尿素氮分別占排泄總氮的 41.7%～90.8%和2.8%～10.5%;暴露于0.076和1.433 mmol/L亞硝酸鹽 24 h后,氨氮占排泄總氮的比例分別下降至10.0%和3.8%,其尿素氮的比例分別上升至58.7%和21.4%,而有機氮的比例則分別上升至 31.3%和74.8%[52]。

尿素可來源于3種途徑: (1)鳥氨酸循環(huán);(2)尿酸分解;(3)精氨酸水解[52]。日本對蝦經(jīng)亞硝酸鹽脅迫后,血淋巴中的氨氮、和精氨酸含量均下降,而尿素含量上升[52]。日本沼蝦經(jīng)1.39 mmol/L亞硝酸鹽暴露 24 h后,肝胰腺和血淋巴中的精氨酸酶活性顯著升高[54],這些結(jié)果表明尿素含量的升高可能來源于鳥氨酸循環(huán)(氨與的合成)或者精氨酸水解[50,52,54]。尿素合成的加強一方面可能為了降低血氨的含量,從而降低血氨與外界攝入的亞硝酸鹽的聯(lián)合毒性[54];另一方面尿素可能起著調(diào)節(jié)滲透壓的作用[50,56](圖 1)。

4.4.4 滲透壓和pH

蝦血清滲透壓隨著亞硝酸鹽脅迫時間的延長呈現(xiàn)逐漸下降的現(xiàn)象,且脅迫濃度越大,下降速度越快。日本囊對蝦經(jīng)0.72 mmol/L亞硝酸鹽脅迫48 h后,滲透壓下降至 884.5 mOsm/kg,為對照組的96.8%[50]。如前所述,在亞硝酸鹽的作用下,蝦血淋巴中的 Cl-、Na+、蛋白質(zhì)和游離氨基酸等含量均下降,是導致血清滲透壓下降的主要原因;另外,蝦體水分含量的升高也是造成滲透壓下降的原因之一[50](圖1)。多種蝦類的研究均發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽會導致血淋巴pH下降[10,16,51,57],含量的下降可能主要原因之一。

4.5 對蝦類免疫功能的影響

凡納濱對蝦置于含有亞硝酸氮 4.0和 8.0 mg/L的水體中養(yǎng)殖 18 d后,其 THC、超氧化物歧化酶(SOD)活力、PO活力、抗菌活力、溶菌活力和血清蛋白含量均顯著下降,亞硝酸氮濃度越高,對蝦的免疫功能越低[27]。紅螯螯蝦置于(0.3～6.0)mg/L亞硝酸鹽下飼養(yǎng)2周后,螯蝦肝胰腺、鰓和肌肉中的酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性均顯著下降,鰓組織 Na+,K+-ATPase和Ca2+,Mg2+-ATPase的活性也呈現(xiàn)下降的趨勢[48]。將凡納濱對蝦暴露于5.15,11.06和21.40 mg/L的亞硝酸氮中 48～168 h,會導致弧菌(Vibrio alginolyticus)注射后的對蝦的死亡率上升;對蝦暴露于4.94,9.87 和19.99 mg/L的亞硝酸氮中,其THC和PO顯著下降。在馬氏沼蝦[36]和羅氏沼蝦[58]的研究中也得到類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明亞硝酸鹽脅迫抑制了對蝦的免疫功能,增加了其對病原體的易感性。

凡納濱對蝦在9.87 和19.99 mg/L的亞硝酸氮暴露96 h后,血細胞的超氧陰離子()含量顯著上升,這些升高的可能對機體產(chǎn)生氧化毒性[2]。日本沼蝦暴露于亞致死濃度的亞硝酸氮水體中24 h后,活性氧(ROS)含量增加 97%,而 SOD、過氧化氫酶(CAT)和GPx活力則分別下降了67%、80.6%和82.7%。ROS含量過高會導致機體受到氧化損傷[59],亞硝酸鹽脅迫使 ROS的產(chǎn)生和清除失衡,從而導致組織受到氧化損傷可能是其毒性機制之一[35]。這一氧化毒性機制在斑節(jié)對蝦血細胞的研究中得到了證實,將斑節(jié)對蝦置于 20 mg/L的亞硝酸氮水體中應激 48 h后,其THC顯著下降,同時ROS含量顯著提高,DNA損傷細胞和凋亡細胞的比例均顯著上升,表明亞硝酸鹽誘導了血細胞產(chǎn)生過量的ROS,這些ROS對血細胞造成了氧化傷害并進一步誘導了細胞凋亡,導致了THC的下降,而THC下降到一定的閥值將會導致蝦的死亡[60](圖1)。

5 展望

上述研究結(jié)果顯示,蝦類的存活、生長發(fā)育、生理代謝和免疫功能等均會受到水體亞硝酸鹽的毒性影響。但是,這些研究仍不夠深入,其毒性影響的作用機制仍不明確。今后可從以下幾個方面開展進一步的研究:

(1)溫度是近年來十分受關(guān)注的環(huán)境因子,研究溫度對亞硝酸鹽毒性的影響及其機制對蝦類的健康養(yǎng)殖有著重要指導意義;(2)近年來的研究認為蝦類存在類免疫球蛋白[61],可進一步開展亞硝酸鹽對這些類免疫球蛋白影響的研究;(3)利用最新的組學技術(shù),研究亞硝酸鹽對蝦類毒性影響的分子機制。

這些研究也表明,亞硝酸鹽是蝦類健康養(yǎng)殖過程中不可忽視的環(huán)境因子,必須進行嚴格的監(jiān)控。但是,亞硝酸鹽的控制是多方面的,其中健康合理的營養(yǎng)投喂是控制亞硝酸鹽的重要因素之一。營養(yǎng)搭配合理的配合飼料不但可以減少蝦類氮廢物的排放,而且可以提高蝦類的免疫功能和抗脅迫能力。但目前針對蝦類抗亞硝酸鹽脅迫能力的研究仍甚少[62,63],未來的研究可更加關(guān)注營養(yǎng)物質(zhì)和各類添加劑[64]在蝦類抗亞硝酸鹽脅迫能力方面的作用。另外,通過現(xiàn)代遺傳育種手段選育抗性強的品系也是提高養(yǎng)殖蝦類抗亞硝酸鹽脅迫能力的重要途徑之一[65]。

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