表達(dá)雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的干酪乳桿菌免疫保護(hù)效力

林紅麗，侯申達(dá)，王嵩，王宇鵬，欒云艷，侯喜林

1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319 2中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510000

表達(dá)雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的干酪乳桿菌免疫保護(hù)效力

林紅麗1，侯申達(dá)2，王嵩1，王宇鵬1，欒云艷1，侯喜林1

1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319 2中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510000

利用干酪乳桿菌作為傳染性法氏囊病毒(IBDV)VP2抗原傳遞系統(tǒng)，探討口服雛雞的免疫次數(shù)、免疫劑量、免疫途徑和攻毒保護(hù)效果。用pLA-VP2重組干酪乳桿菌對(duì)5日齡雛雞進(jìn)行二次和三次免疫，并設(shè)108、109、1010CFU/m L的重組干酪乳桿菌組，間接ELISA檢測(cè)血清IgG和小腸洗液sIgA，末免后7 d攻毒，計(jì)算保護(hù)效果。根據(jù)確定的2次免疫和109CFU/m L免疫劑量免疫5日齡雛雞，分別口服、滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/ L.casei，口服、肌注商品活苗及口服pLA/L.casei和PBS為對(duì)照，監(jiān)測(cè)IgG和sIgA抗體水平；末免后7 d檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖情況并攻毒，7 d后剖檢，觀察法氏囊損傷程度并記錄病變得分和保護(hù)率。結(jié)果表明各組的特異性sIgA、IgG抗體水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；口服pLA-VP2/L.casei組的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)顯著高于其他組(P<0.01)，保護(hù)率高達(dá)83.3%，免疫保護(hù)效果優(yōu)于滴鼻/點(diǎn)眼組。因此，構(gòu)建的重組干酪乳桿菌的安全性優(yōu)于商品活苗，可以作為IBDV候選疫苗。

傳染性法氏囊病毒(IBDV)，VP2蛋白，重組干酪乳桿菌，黏膜免疫，免疫次數(shù)，免疫劑量，免疫途徑，保護(hù)率

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由雞傳染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的雛雞高度接觸性傳染性疾病，是影響世界養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一[1]。在易感的雞體中，病毒主要侵害雞的免疫器官，致使機(jī)體發(fā)生免疫抑制。鑒于市場上抗IBDV商品疫苗在免疫過程中易對(duì)法氏囊造成損傷，近十幾年，國內(nèi)外學(xué)者正致力于抗IBDV基因工程亞單位疫苗的研制。1996年，以色列的Pitcovski等[2]利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)VP2蛋白，并通過免疫攻毒試驗(yàn)檢驗(yàn)對(duì)雞的保護(hù)效果。重組VP2蛋白免疫組攻毒保護(hù)率達(dá)100%。1998年，澳大利亞的Sheppard等[3]利用禽腺病毒表達(dá)VP2蛋白，證明皮下注射方式可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高的抗體水平。1999年，日本的Tsukamoto等[4]利用重組的馬立克氏病病毒(MDV)表達(dá)IBDV VP2蛋白，該重組疫苗對(duì)IBDV和MDV均可以提供較好的保護(hù)。2007年，浙江大學(xué)的Wu等[5]利用轉(zhuǎn)基因稻米種子表達(dá)VP2蛋白，可以有效地保護(hù)機(jī)體抵抗IBDV的感染。

乳酸菌除了可以在胃腸道內(nèi)定植，抑制病菌之外[6]，它還可以作為外源基因表達(dá)遞送的載體。近十幾年里，國內(nèi)外研究人員已在乳酸桿菌中表達(dá)多種蛋白。2003年，美國的Dieye等[7]利用乳酸菌表達(dá)的IBDV VP2和VP3蛋白，具有較好的反應(yīng)原性。2005年，Raha等[8]應(yīng)用乳酸菌表達(dá)大腸桿菌自溶酶AcmA，獲得約15 kDa的目的蛋白條帶，且具有較好的反應(yīng)原性，自溶酶AcmA蛋白成功展示在乳酸菌表面。2010年，溫麗娟等[9]用乳酸菌表達(dá)大腸桿菌K 88、K99基因，成功構(gòu)建了pLA-K88-K99重組干酪乳桿菌。通過口服和滴鼻/點(diǎn)眼途徑免疫6?8周齡SPF級(jí)小鼠，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的特異性抗體。攻毒保護(hù)性試驗(yàn)檢測(cè)其保護(hù)效率達(dá)到75%以上，而對(duì)照組死亡率達(dá)100%。本研究利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的抗IBDV重組干酪乳桿菌分別經(jīng)口服和滴鼻/點(diǎn)眼途徑免疫雛雞，并通過攻毒試驗(yàn)檢測(cè)其免疫保護(hù)效力，為雞傳染性法氏囊病的基因工程黏膜疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、病毒、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

干酪乳桿菌pHCE1LB-pgsA(pLA)由本實(shí)驗(yàn)室保存；干酪乳桿菌陽性重組菌株pLA-VP2/ L.casei由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；IBDV毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，命名為DQ株；IBDV B87株商品疫苗購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司；所用培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基，試驗(yàn)用雞為商品蛋雞。

1.1.2 主要試劑

R＆D IBDV IgG ELISA檢測(cè)試劑盒、sIgA ELISA檢測(cè)試劑盒購自北京奇松生物科技有限公司；HyClone 1640細(xì)胞培養(yǎng)液；美國Gibco公司胎牛血清，Solarbio谷氨酰胺；MERCK胰蛋白酶；天津?yàn)畼由镏破酚邢挢?zé)任公司的雞淋巴細(xì)胞分離液。

1.2 方法

1.2.1 重組干酪乳桿菌的表達(dá)

重組干酪乳桿菌的培養(yǎng)參照溫麗娟等[9]發(fā)表的方法。取保存的重組菌按2%接種在6 m L含34 μg/m L氯霉素的MRS液體培養(yǎng)基中，厭氧條件下靜止培養(yǎng)過夜。次日，取過夜培養(yǎng)活化的菌液按2%接種于100 m L含34 μg/m L氯霉素MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。表達(dá)6 h后，5 000 r/min離心5 m in，收集菌體沉淀，用PBS洗滌3次，用顯微鏡進(jìn)行菌體計(jì)數(shù)，將菌液稀釋成5×109CFU/m L乳酸菌懸液，用于接種免疫。

1.2.2 IBDV超強(qiáng)毒半數(shù)感染量(ID50)測(cè)定

21日齡商品雞隨機(jī)分成7組，每組7只(0.1 m L/只)，每組攻毒劑量分別為100、10–1、10–2、10–3、10–4、10–5和10–6，攻毒后觀察并記錄雞的死亡數(shù)量及法氏囊病變數(shù)量，應(yīng)用Reed-Muench法[10]計(jì)算ID50。

1.2.3 免疫劑量及免疫次數(shù)試驗(yàn)

5日齡雞隨機(jī)分成A、B兩組，每組40只，設(shè)A組免疫程序?yàn)閮纱蚊庖呓M(5日齡?9日齡一免，13?17日齡二免)，B組為3次免疫組(5日齡?9日齡一免，13?17日齡二免，21?25日齡三免)，每次免疫均連續(xù)免疫5 d。A1、A2、A3組和B1、B2、B3組，每組10只，分別口服免疫108、109、1010CFU/m L的重組干酪乳桿菌(0.1 m L/只)，對(duì)照組Ac、Bc每組10只(表1)，口服免疫同等劑量的PBS，每次免疫后采血，收集血清并收集胃腸道沖洗液，應(yīng)用間接ELISA檢測(cè)血清IgG和胃腸道洗液sIgA效價(jià)。

表1 免疫劑量和免疫次數(shù)試驗(yàn)分組Tab le 1 G rouping of imm unization dosages and tim es experim ent

A、B兩組分別在末免后7 d攻毒DQ株，劑量為103ID50(0.1 m L/只)，并設(shè)攻毒PBS對(duì)照組Ac1、Bc1，和未攻毒PBS對(duì)照組Ac2、Bc2，每組5只。在攻毒后7 d安樂死，記錄每只雞體重和法氏囊重，計(jì)算法氏囊重/體重，比率用BBWR(Bursa-to-body weight ratio)表示。剖檢法氏囊，記錄法氏囊眼觀病變。攻毒保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)參照Huang等發(fā)表的方法[11]，并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，保護(hù)效果判定標(biāo)準(zhǔn)：1)臨床上沒有出現(xiàn)發(fā)病和死亡；2)法氏囊眼觀病變得分[12]，記錄得分為0的雞的數(shù)量；3)計(jì)算BBWR，與陰性對(duì)照組平均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差相比，小于該值即判定為陰性，記錄各組雞陰性數(shù)量(表2)。

1.2.4 免疫途徑試驗(yàn)

5日齡雞隨機(jī)分成A、B、C、D、E、F，共計(jì)6組，每組24只。A組為口服pLA-VP2/L.casei重組菌，B組為滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei，C組為口服pLA/L.casei，D組為口服IBDV活疫苗，E組為肌肉注射IBDV活疫苗，F(xiàn)組為口服PBS空白對(duì)照組，每只劑量為100 μL，A、B、C、F免疫程序及接種菌量按3.2.2最優(yōu)選擇(免疫次數(shù)為兩次免疫，免疫劑量為109CFU/m L， 0.1 m L/只)，C、D組按商品化疫苗免疫程序。分別取免疫前、免疫后不同免疫時(shí)間的血清，檢測(cè)特異性IgG抗體水平，取眼結(jié)膜、鼻腔、肺泡、胃、小腸沖洗液，檢測(cè)特異性sIgA。每組取4只在末免后7 d取脾臟，用于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。

表2 法氏囊眼觀病變得分Tab le 2 Criteria forevaluation of gross lesion in the bursa

1.2.5 血清采集

各組分別于免疫前和免疫后5、10、15、20、25、30和35 d對(duì)雞通過心臟采集抗凝血，將采好的血置于37℃溫箱，1 h后取出，4℃過夜靜置，次日3 000 r/m in離心15 m in，此時(shí)上清黃色液體即為血清，收集血清，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 小腸、支氣管肺泡、眼結(jié)膜及鼻腔沖洗液采集

對(duì)雞安樂死后打開腹腔和胸腔，暴露雞小腸、支氣管和肺臟，用注射器吸取PBS沖洗，反復(fù)3次，每次200 μL，收集洗液，用注射器取200 μL PBS反復(fù)沖洗眼結(jié)膜和鼻腔，收集眼部和鼻腔沖洗液，3 000 r/m in離心10 m in，收集上清，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 間接ELISA檢測(cè)血清IgG和沖洗液sIgA

利用ELISA試劑盒檢測(cè)血清IgG和小腸沖洗液、肺泡沖洗液、眼結(jié)膜鼻腔沖洗液sIgA抗體水平，檢測(cè)過程嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，以試劑盒帶有的陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品為參照，OD450高于陰性對(duì)照的均判定為陽性。

1.2.8 脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖試驗(yàn)

脾臟T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)參照Pradhan等[13]發(fā)表的方法。試驗(yàn)各組在末免后7 d每組取4只雞，安樂死，取出脾臟；研磨脾臟，制成脾細(xì)胞懸液；將單細(xì)胞懸液用1640培養(yǎng)液稀釋，細(xì)胞數(shù)為2×106個(gè)/m L，然后加入96孔板中，設(shè)4個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。試驗(yàn)組用ConA刺激，陰性對(duì)照組應(yīng)用培養(yǎng)液刺激，同時(shí)設(shè)不加脾細(xì)胞，只加培養(yǎng)液和只加ConA作為空白對(duì)照，然后置于5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)72 h。應(yīng)用MTT比色法[14]檢測(cè)脾細(xì)胞增殖情況。用分光光度計(jì)檢測(cè)OD490吸光度。用刺激指數(shù)(Stimulation index,S.I.)反映增殖情況。

刺激指數(shù)(S.I.)=受到刺激的細(xì)胞OD490吸光度/陰性對(duì)照的細(xì)胞OD490吸光度。

1.2.9 攻毒試驗(yàn)

口服pLA-VP2/L.casei組、滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組、口服pLA/L.casei組、口服IBDV活疫苗組、肌肉注射IBDV活疫苗組中每組20只，在末免后7 d對(duì)每組進(jìn)行攻毒，劑量為103ID50，每只100 μL；F組(PBS組)隨機(jī)分成兩組，分別為F1和F2組，F(xiàn)1組為攻毒PBS對(duì)照組，F(xiàn)2組為未攻毒PBS對(duì)照組。攻毒后觀察每組雞，檢測(cè)保護(hù)效果。保護(hù)效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照1.2.3，取法氏囊做病例組織切片。

1.2.10 病理切片的制作

采用常規(guī)切片制作方法，攻毒后7 d的雞安樂死，取法氏囊，將法氏囊切成1 cm×1 cm的組織塊，經(jīng)固定、脫水、透明、包埋、切片、染色、脫蠟復(fù)水、蘇木精染色、伊紅染色、脫水、透明、封固后便可在顯微鏡下用40×視野下觀察。

2 結(jié)果

2.1 半數(shù)感染量(ID50)的測(cè)定

應(yīng)用Reed-Muench法測(cè)半數(shù)感染量(ID50)，測(cè)得傳染性法氏囊病毒(IBDV)的ID50為 10–3.2/100 μL。

2.2 免疫次數(shù)及免疫劑量試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 間接ELISA檢測(cè)血清IgG結(jié)果

通過間接ELISA檢測(cè)每組血清中IgG水平，結(jié)果顯示，二次免疫和三次免疫組IgG水平顯著高于一次免疫組(P<0.01)，二次免疫和三次免疫差異不顯著(P＞0.05)。在二次免疫組中，109CFU/m L和1010CFU/m L組抗體水平均顯著高于108CFU/m L和PBS(P<0.01)，109CFU/m L和1010CFU/m L組抗體水平差異不顯著(P＞0.05) (圖1)。

2.2.2 間接ELISA檢測(cè)小腸沖洗液sIgA結(jié)果

通過間接ELISA檢測(cè)每組小腸沖洗液sIgA水平，結(jié)果顯示，三次免疫組和二次免疫組sIgA水平顯著高于一次免疫組(P<0.01)，二次免疫組和三次免疫組差異不顯著(P＞0.05)；在二次免疫組和三次免疫組中，109CFU/m L和1010CFU/m L組抗體水平均顯著高于108CFU/m L和對(duì)照組(P<0.01)，而109CFU/m L和1010CFU/m L組無顯著差異(P＞0.05)(圖2)。

圖1 間接ELISA檢測(cè)血清IgG抗體水平Fig.1 Serum IgG antibody titres in OD450detected by indirect ELISA.

圖2 間接ELISA檢測(cè)小腸洗液sIgA水平Fig.2 sIgA antibody titres in OD450detected by indirect ELISA.

2.2.3 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

二次免疫組和三次免疫組攻毒對(duì)照組雞均表現(xiàn)出20%的死亡率和100%發(fā)病率，未攻毒對(duì)照組均無死亡和發(fā)病情況；二次免疫組免疫劑量為108CFU/m L組無死亡情況，但發(fā)病率為40%，109CFU/m L、1010CFU/m L組無死亡，發(fā)病率為20%；三次免疫組108CFU/m L無死亡情況，發(fā)病率為30%，109CFU/m L、1010CFU/m L組無死亡率，發(fā)病率為20%。

法氏囊眼觀病理變化試驗(yàn)A組為二次免疫組，B組為三次免疫組；A1、A2、A3為A組不同免疫劑量試驗(yàn)組(10 CFU/m L、109CFU/m L、1010CFU/m L)，AC1為陽性對(duì)照組，AC2為陰性對(duì)照組；B1、B2、B3為B組不同免疫劑量試驗(yàn)組，BC1為陽性對(duì)照組，BC2為陰性對(duì)照組(表3)。

攻毒后對(duì)雞安樂死，記錄各組雞體重與法氏囊重，計(jì)算比率BBWR。BBWR=法氏囊重×1 000/體重。每組計(jì)算BBWR平均值，并應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。記錄法氏囊病變得分為0的雞數(shù)量，計(jì)算干酪乳桿菌口服疫苗保護(hù)率。最終保護(hù)率計(jì)算以1.2.9中的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分別計(jì)算保護(hù)率，最終取平均值。結(jié)果顯示，二次免疫109CFU/m L和1010CFU/m L組保護(hù)率均為80%，108CFU/m L組保護(hù)率為60%；三次免疫109CFU/m L和1010CFU/m L組保護(hù)率為80%，108CFU/m L組保護(hù)率為70%(表4)。

表3 法氏囊眼觀病理變化得分Tab le 3 Score of gross lesions in the bursa

表4 口服重組干酪乳桿菌保護(hù)率Tab le 4 Protectiveratio of orally vaccinating the recom bination L.casei

2.3 免疫途徑試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 間接ELISA檢測(cè)血清IgG結(jié)果

對(duì)免疫前和免疫后各組的雞采血，在不同時(shí)間心臟采血，收集血清，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，并繪制生長曲線，觀察IgG抗體消長規(guī)律。結(jié)果顯示，免疫前雛雞在母源抗體存在條件下，抗體效價(jià)均較高，但在5日齡(一免)時(shí)開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(檢測(cè)結(jié)果略)，PBS對(duì)照組顯示抗體水平在免疫后10 d到達(dá)最低值，并趨于穩(wěn)定；而口服pLA-VP2/L.casei和肌注商品活苗組血清IgG抗體效價(jià)顯著高于其他組；滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei稍低于上述兩組，但顯著高于其他3組；然而，肌注商品活苗組在免疫后25 d時(shí)抗體效價(jià)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，口服pLA-VP2/ L.casei組抗體效價(jià)呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)；各組在一免后抗體效價(jià)均呈現(xiàn)緩慢增長，二免后呈明顯上升趨勢(shì)，而對(duì)照組抗體效價(jià)變化不明顯(圖3)。

2.3.2 間接ELISA檢測(cè)小腸、肺泡、眼結(jié)膜鼻腔沖洗液sIgA結(jié)果

間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，口服pLAVP2/L.casei和口服商品活苗組sIgA抗體效價(jià)顯著高于其他組(P<0.01)；但口服商品活苗組在免疫后25 d時(shí)抗體效價(jià)開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，口服pLA-VP2/L.casei組可以維持較穩(wěn)定的抗體水平；滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組低于上述兩組(P<0.05)；對(duì)照組抗體效價(jià)變化不顯著(P＞0.05)(圖4)。

圖3 間接ELISA檢測(cè)不同免疫期血清IgG抗體效價(jià)Fig.3 Serum IgG antibody titres in OD450detected by indirect ELISA in the different immunity period.

圖4 間接ELISA檢測(cè)小腸沖洗液sIgA抗體效價(jià)Fig.4 sIgA antibody titres in OD450detected by indirect ELISA in small intestine washing fluid.

肺泡沖洗液檢測(cè)結(jié)果顯示，滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組抗體效價(jià)顯著高于其他5組(P<0.01)，并且可以在免疫后20 d開始維持較穩(wěn)定的抗體水平，但該組肺泡沖洗液中sIgA抗體效價(jià)(OD450<1.5)，顯著低于口服pLA-VP2/ L.casei組小腸洗液sIgA抗體效價(jià)(OD450＞1.5)。肺泡洗液中sIgA抗體效價(jià)口服組顯著低于滴鼻點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組(P<0.01)，對(duì)照組抗體水平變化不顯著(P＞0.05)(圖5)。

眼結(jié)膜、鼻腔沖洗液檢測(cè)結(jié)果顯示，滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組抗體效價(jià)顯著高于其他5組(P<0.01)，且在免疫后20 d達(dá)到最大值，并且開始趨于穩(wěn)定，對(duì)照組抗體水平變化不大(圖6)。

2.3.3 脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果

脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，ConA刺激組刺激指數(shù)顯著高于1640對(duì)照組(P<0.01)；兩組中口服pLA-VP2/L.casei組的刺激指數(shù)均顯著高于口服活苗組、肌注活苗組、口服pLA/L.casei組和PBS組(P<0.01)，顯著高于滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組(P<0.05)(圖7)。

圖5間接ELISA檢測(cè)肺泡沖洗液sIgA抗體效價(jià)Fig.5 sIgA antibody titres in OD450detected by indirect ELISA in pulmonary alveoli washing fluid.

2.3.4 剖檢法氏囊病變和保護(hù)率結(jié)果

攻毒PBS對(duì)照組和pLA/L.casei對(duì)照組雞均表現(xiàn)出10%的死亡率和100%發(fā)病率，未攻毒PBS對(duì)照組無死亡和發(fā)病情況；口服pLA-VP2/ L.casei組和滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組無死亡情況，發(fā)病率分別為15%和20%，口服商品活苗組無死亡率，發(fā)病率為40%；肌注商品活苗組無死亡率，發(fā)病率為35%。

圖7 脾臟T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)Fig.7 Spleen T lymphocyte proliferation test.1: ConA stimulator group;2:1640 culture fluid stimulator group.

表5 法氏囊眼觀病理變化得分Tab le 5 Score of gross lesions in the bursa

表6 pLA-VP2重組干酪乳桿菌保護(hù)率Tab le 6 Protective ratio of recom binant Lactobacillus casei

法氏囊眼觀病變綜合得分結(jié)果顯示，口服pLA-VP2/L.casei組和滴鼻點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組得分低于其他組，口服pLA-VP2/L.casei比滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei分?jǐn)?shù)略低(表5)。

攻毒7 d后雞安樂死，記錄各組雞體重與法氏囊重，計(jì)算比率BBWR。計(jì)算方法參照2.2.3。結(jié)果顯示，口服pLA-VP2/L.casei組保護(hù)率達(dá)80%以上，滴鼻/點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組保護(hù)率為75%，其他組保護(hù)率均在50%以下(表6)。

2.3.5 法氏囊組織病理學(xué)檢查結(jié)果

法氏囊病理切片結(jié)果顯示，未攻毒PBS對(duì)照組髓質(zhì)濾泡飽滿，泡間組織正常；肌肉注射商品活苗組和口服pLA/L.casei髓質(zhì)形成空泡，淋巴濾泡退化，如箭頭所示；口服pLA-VP2/ L.casei組濾泡正常，無明顯的病變；滴鼻點(diǎn)眼pLA-VP2/L.casei組淋巴濾泡正常，在法氏囊基膜下有少量紅細(xì)胞，法氏囊輕微損傷；攻毒PBS對(duì)照組髓質(zhì)形成空泡，淋巴細(xì)胞損傷，淋巴濾泡退化，法氏囊呈現(xiàn)嚴(yán)重病灶，如箭頭所示(圖8)。

圖8 法氏囊病理學(xué)變化(顯微鏡40×視野)Fig.8 Histological pathologicalchanges in the bursa. (A)Unchallenge PBS control.(B)Commercial vaccine i.m..(C)pLA/L.casei oral.(D)pLA-VP2/L.casei oral. (E)pLA-VP2/L.casei intraocular-nasal.(F)Challenge PBS control.

3 討論

目前現(xiàn)場常常使用中等毒力的弱毒活苗來預(yù)防IBDV感染，但是當(dāng)有高水平母源抗體存在的情況下實(shí)施免疫常常會(huì)造成免疫失敗，母源抗體低又會(huì)造成雞法氏囊的損傷，如果免疫期不正確這種損傷會(huì)更加嚴(yán)重[13]。因此，許多學(xué)者致力于尋找新的免疫策略，在母源抗體存在的情況下仍然能夠誘導(dǎo)局部和系統(tǒng)免疫的黏膜疫苗研究引起了廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)采用乳桿菌作為IBDV抗原的載體系統(tǒng)，初步探討了免疫途徑和免疫劑量對(duì)雛雞的免疫效果。乳酸菌作為外源抗原遞送載體經(jīng)口服進(jìn)入機(jī)體后在機(jī)體胃腸道定植，首先接觸小腸黏膜，誘導(dǎo)小腸黏膜免疫產(chǎn)生sIgA[15]。乳酸菌表面攜帶有VP2外源蛋白，通過胃腸道在小腸定植后，小腸黏膜表面的免疫細(xì)胞快速識(shí)別特異性抗原，然后將抗原直接呈遞到小腸黏膜，被腸黏膜的漿細(xì)胞識(shí)別后，產(chǎn)生sIgA，發(fā)生局部的黏膜免疫[16]。而乳酸菌處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，外源蛋白的表達(dá)量隨菌體繁殖逐漸提高，但當(dāng)菌體繁殖處于穩(wěn)定期時(shí)，即使繼續(xù)增加表達(dá)時(shí)間，蛋白表達(dá)量也不再提高，這可能就是二次免疫誘導(dǎo)的sIgA抗體水平與三次免疫差異不顯著的原因。本研究中間接ELISA檢測(cè)IgG，三次免疫和二次免疫免疫抗體水平差異不顯著，這可能也是由于乳酸菌處于穩(wěn)定期，蛋白表達(dá)量已經(jīng)達(dá)到最大值，誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫水平已處于最高峰，因此即使提高菌體數(shù)量，增加免疫次數(shù)也不會(huì)對(duì)免疫效果產(chǎn)生影響。

在攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，從各組法氏囊眼觀病變計(jì)算的平均得分結(jié)果可以看出二次免疫組和三次免疫組得分均低于攻毒PBS對(duì)照組，而二次免疫組得分與三次免疫組相同；109CFU/m L和1010CFU/m L法氏囊病變得分低于陽性對(duì)照組，109CFU/m L和1010CFU/m L法氏囊病變得分差別較小。這也證明了二次免疫，免疫劑量為109CFU/m L即可保護(hù)雞抵抗IBDV感染，這一結(jié)果與間接ELISA檢測(cè)結(jié)果相符。因此，確定的免疫次數(shù)為二次免疫，免疫菌體數(shù)量為109CFU/m L。

乳酸菌疫苗抵抗IBDV感染的免疫應(yīng)答是通過Th2及其產(chǎn)物IgG1實(shí)現(xiàn)的。然而通過黏膜途徑遞送表達(dá)的VP2外源蛋白既可以誘導(dǎo)IgG1，也可以誘導(dǎo)IgG2，原因可能是Th1型細(xì)胞因子促進(jìn)了其向IgG2a類別轉(zhuǎn)換，而抑制了與Th2型免疫應(yīng)答有關(guān)的IgG1的抗體水平[17]。由此推斷乳酸菌疫苗促進(jìn)了輔助型T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。具有Th1和Th2型細(xì)胞因子的特異性的IBDV VP2輔助型T細(xì)胞在胃內(nèi)免疫途徑中常常被發(fā)現(xiàn)，尤其是腸內(nèi)和脾臟中[16]。因此通過口服方式免疫應(yīng)該是較好的免疫途徑，這與本研究中間接ELISA檢測(cè)特異性抗體試驗(yàn)結(jié)果相符。

間接ELISA檢測(cè)血清IgG結(jié)果顯示口服重組菌組血清抗體水平和肌注商品活苗組抗體水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，且這兩組抗體水平差異不顯著(P＞0.05)。然而，間接ELISA檢測(cè)血清中IgG抗體時(shí)，在免疫后25 d內(nèi)，肌注商品活苗血清IgG抗體水平略高于口服重組菌組，但在25 d后肌注商品活苗組抗體水平開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且于免疫后30 d開始低于口服重組菌組，而口服重組菌組在免疫后20 d抗體水平最高，而且呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)。2009年，齊炳理等[18]利用乳酸菌表達(dá)IBDV VP2蛋白免疫保護(hù)效果研究中證實(shí)，SPF雞免疫后21 d試驗(yàn)組與對(duì)照組相比抗體水平有顯著差異，免疫后36 d抗體水平達(dá)到最大值，這一結(jié)果的不同可能與本研究用商品蛋雞有關(guān)。

在攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，肌注活苗組的雞法氏囊具有顯著的眼觀病理變化，組織病理切片中也有體現(xiàn)，口服重組菌組法氏囊沒有明顯的病變。由此可見，商品苗在免疫初期抗體水平較高，但抗體水平不穩(wěn)定，而本研究構(gòu)建的重組乳酸菌雖然誘導(dǎo)的抗體水平低于商品苗，但免疫后誘導(dǎo)機(jī)體抗體水平穩(wěn)定，且安全性明顯優(yōu)于商品活疫苗；ELISA檢測(cè)小腸、肺泡和眼結(jié)膜鼻腔沖洗液sIgA結(jié)果顯示，口服重組菌組小腸中sIgA水平顯著高于其他組(P<0.01)，滴鼻點(diǎn)眼組肺泡和眼結(jié)膜鼻腔沖洗液中sIgA水平顯著高于其他組(P<0.01)，但sIgA抗體水平明顯低于口服組小腸沖洗液(P<0.01)。綜上，確定重組干酪乳桿菌免疫途徑是口服免疫。分析本試驗(yàn)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雖然商品弱毒活疫苗的免疫誘導(dǎo)了高水平的特異性IgG抗體，但是免疫保護(hù)效果卻很低，原因可能是保護(hù)效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)不同，評(píng)價(jià)角度不同，沒有使用單一的攻毒死亡率來評(píng)價(jià)保護(hù)效果[19-20]，而是參考了Huang等[11]的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。商品疫苗的保護(hù)率一般是以沒有發(fā)病癥狀為標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算的，本試驗(yàn)除了這個(gè)指標(biāo)外，還增加了法氏囊病理損傷和BBWR指標(biāo)，因此試驗(yàn)中商品疫苗的保護(hù)率低。

本研究通過免疫后檢測(cè)血清IgG和胃腸道、肺泡和眼結(jié)膜鼻腔沖洗液sIgA抗體水平及攻毒后的病理指標(biāo)，確定了pLA-VP2重組干酪乳桿菌的免疫次數(shù)、免疫劑量及免疫途徑。pLA-VP2重組干酪乳桿菌可能會(huì)成為未來預(yù)防雞傳染性法氏囊病的有效的疫苗產(chǎn)品，同時(shí)將會(huì)為禽類其他疾病口服基因工程黏膜疫苗研制提供可借鑒的參考。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Immunogenicity of recombinant Lactobacillus casei expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus in chickens

Hongli Lin1,Shenda Hou2,Song Wang1,Yupeng Wang1,Yunyan Luan1,and Xilin Hou1
1 College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,Heilongjiang,China 2 Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510000,Guangdong,China

In order to determ ine immunogenicity and protective effect in chickens,we used the IBDV(Infectious bursal disease virus)-Vp2/Lactobacillus casei as antigen transfer system.First,the immunized and control chickens were challenged by IBDV/DQ at lethal dose to determ ine the protective ratio.Second,chickens were orallyand intranasally vaccinated tw ice w ith 109CFU/m L pLA-VP2/L.casei,pLA/L.casei and PBS as negativecontrol and commercial vaccine as positive control.The bursa injury and the lesion score wererecorded post challenge.The level of specific IgG and sIgA in pLA-VP2/L.casei and positive control groups was significantly higher than that in negativecontrol groups.The protection efficacy in pLA-VP2/L.casei oral group was higher than that inintranasal group.The SI.of pLA-VP2/L.casei oral group was significant higher than other groups.The lesion score indicated the pLA-VP2/L.casei was safer than commercial vaccine for bursa.Collectively,the pLA-VP2/L.casei could be a vaccine candidate for IBDV.

infectious bursal disease virus,VP2 protein,recombinant Lactobacillus casei,mucosalimmunity,immunization times,immunization dosage,immunization wags,protective ratio

January 10,2014;Accep ted:April 18,2014

Xilin Hou.Tel/Fax:+86-459-6819292;E-mail:xly_hou@163.com

林紅麗,侯申達(dá),王嵩,等.表達(dá)雞傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的干酪乳桿菌免疫保護(hù)效力的研究.生物工程學(xué)報(bào), 2014,30(11):1679–1690.

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Suppo rted by:Heilongjiang Postgraduates'Innovation Project(No.YJSCX 2013-11BYND).

黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(No.YJSCX 2013-11BYND)資助。

時(shí)間：2014-10-10網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140021.htm l