兩種UDP-葡萄糖脫氫酶對透明質(zhì)酸生物轉(zhuǎn)化的影響

郭東會(huì)，韓劍，劉偉豐，傅震洲，朱啟忠，陶勇

1山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東威海264209 2中國科學(xué)院微生物研究所，北京100101

工業(yè)生物技術(shù)

兩種UDP-葡萄糖脫氫酶對透明質(zhì)酸生物轉(zhuǎn)化的影響

郭東會(huì)1，韓劍2，劉偉豐2，傅震洲2，朱啟忠1，陶勇2

1山東大學(xué)海洋學(xué)院，山東威海264209 2中國科學(xué)院微生物研究所，北京100101

分別從大腸桿菌和化膿鏈球菌中擴(kuò)增出編碼UDP-葡萄糖脫氫酶基因ecohasB和spyhasB，并將其插入T7表達(dá)載體pRX2構(gòu)建重組質(zhì)粒pRXEB和pRXSB。在大腸桿菌BL21(DE3)中重組表達(dá)，并對經(jīng)鎳柱純化后的UDP-葡萄糖脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：spy HasB的最適反應(yīng)溫度是30℃，最適pH 10，最適條件下的比活力是12.2 U/mg；eco HasB的最適反應(yīng)溫度是30℃，最適pH 9，最適條件下的比活力是5.55 U/mg。從多殺巴氏桿菌擴(kuò)增出的透明質(zhì)酸合成酶基因pmuhasA分別與ecohasB和spyhasB構(gòu)建共表達(dá)載體pBPAEB和pBPASB。將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BW 25113中，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)透明質(zhì)酸(HA)，并對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：重組菌株進(jìn)行透明質(zhì)酸轉(zhuǎn)化時(shí)，UDP-葡萄糖脫氫酶酶活力越高，穩(wěn)定性越好，HA產(chǎn)量越高；轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，pBPAEB/BW 25113和pBPASB/BW 25113在搖瓶中的產(chǎn)量分別是1.52和1.70 g/L，比之前報(bào)道的提高了2?3倍。

UDP-葡萄糖脫氫酶，酶學(xué)性質(zhì)，透明質(zhì)酸，生物轉(zhuǎn)化

透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)是一種糖胺聚糖，它是由D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰葡萄糖胺(NAG)以β(1→3)和β(1→4)糖苷鍵交替連接的二糖結(jié)構(gòu)單位組成[1]，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[2-4]。目前，全球市場對HA產(chǎn)品需求超過十億美元[5]。

HA最早是從動(dòng)物組織中提取，但存在來源困難、價(jià)格昂貴、提取工藝復(fù)雜、HA產(chǎn)量低、有跨種屬病毒傳染風(fēng)險(xiǎn)等諸多缺點(diǎn)。與動(dòng)物組織提取相比，微生物發(fā)酵生產(chǎn)HA具有原料充足、成本低、易于分離純化、可以大規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)酵生產(chǎn)HA起始于20世紀(jì)80年代，主要的生產(chǎn)菌株是獸疫鏈球菌，目前發(fā)酵產(chǎn)量可以達(dá)到6?7 g[6]，近來研究者主要通過誘變、發(fā)酵條件優(yōu)化[7]等方式提高HA產(chǎn)量，但獸疫鏈球菌是潛在的致病菌，其生產(chǎn)的HA在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用受到了限制。因此，重組菌生產(chǎn)HA已成為一個(gè)趨勢。目前，國內(nèi)外已報(bào)道過的重組菌包括土壤農(nóng)桿菌[8]、乳酸菌[9]、枯草芽胞桿菌[10]、嗜熱鏈球菌[11]和大腸桿菌[12-13]。與上述其他菌株相比，大腸桿菌具有易于培養(yǎng)、發(fā)酵條件容易控制、遺傳背景清晰、遺傳操作成熟、有大量的調(diào)控元件、調(diào)控模塊可供選擇等優(yōu)勢[13-14]，因此重組的大腸桿菌可以成為HA生物轉(zhuǎn)化的良好宿主。

UDP-葡萄糖脫氫酶(UDP-glucose dehydrogenase，簡稱UGDH，EC 1.1.1.22)催化2分子的NAD和1分子UDP-葡萄糖(UDP-Glc)生成2分子的NADH和1分子UDP-葡糖醛酸(UDP-GlcA)[15]，生成的UDP-GlcA是參與HA合成的前體物質(zhì)之一。

目前，國內(nèi)外主要對來源于超嗜熱古菌-冰島熱棒菌hyperthermophilic Archaeon Pyrobaculum islandicum[16]、海洋真菌草莖點(diǎn)霉Phoma herbarum YS4108[17]、鞘氨醇單胞菌Sphingomonas elodea[18]、大腸桿菌Escherichia coli[19]和化膿鏈球菌Streptococcus pyogenes[20]UDP-葡萄糖脫氫酶的性質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道。大腸桿菌K5來源的kfiD[13]，大腸桿菌K12來源的ugd[12]，枯草芽胞桿菌來源的tuaD[10]和鏈球菌來源的hasB[11]用于在重組菌中發(fā)酵生產(chǎn)HA。2009年，Sheng等[21]在重組乳酸菌合成HA的過程中發(fā)現(xiàn)，高活性的UDP-葡萄糖脫氫酶更有利于HA的生成。2005年，W indner等[10]發(fā)現(xiàn)重組枯草芽胞桿菌中，UDP-GlcA限制了HA的合成。2008年，Yu等[12]分析發(fā)現(xiàn)ecohasB基因的過表達(dá)能顯著提高HA的產(chǎn)量。這些研究結(jié)果表明UDP-葡萄糖脫氫酶是透明質(zhì)酸合成過程中的關(guān)鍵酶，因此有必要在HA生產(chǎn)菌株中篩選和優(yōu)化UDP-葡萄糖脫氫酶基因。

本研究對大腸桿菌K12來源的eco HasB和化膿鏈球菌來源的spy HasB酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較分析。首次將多殺性巴氏桿菌的hasA基因分別與ecohasB和spyhasB基因在大腸桿菌BW 25113中共表達(dá)，采用生物轉(zhuǎn)化的方法生產(chǎn)透明質(zhì)酸，并對轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過UGDH酶學(xué)性質(zhì)的比較和重組菌株HA產(chǎn)量的分析，闡明其在HA生產(chǎn)中的作用，這為后期大規(guī)模生產(chǎn)HA提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

pRX2和pBAD-HisB質(zhì)粒，大腸桿菌BW 25113和大腸桿菌BL21(DE3)菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存；多殺巴氏桿菌購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，菌株編號(hào)CVCC408；化膿鏈球菌為中國科學(xué)院微生物研究所王北難課題組提供。

1.1.2 主要試劑

UDP-葡萄糖和NAD購于Sigma公司；N-乙酰葡萄糖胺購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；DNA marker和Protein marker購于Fermentas公司；TransStart Fast Pfu DNA Polymerase購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA連接酶購于Promega公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、普通DNA回收試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基和溶液

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，5 g/L甘油，0.5 g/L葡萄糖，2 g/L阿拉伯糖或者2 g/L乳糖，25 mmol/L磷酸氫二鈉，50 mmol/L氯化銨，25 mmol/L磷酸二氫鉀，5 mmol/L硫酸鈉，2 mmol/L的硫酸鎂，50 mmol/L氯化亞鐵，0.02 mmol/L氯化鈣，0.01 mmol/L氯化鎂，0.01 mmol/L硫酸鋅，0.002 mmol/L氯化鈷、氯化銅、氯化鎳、鉬酸鈉、亞硒酸鈉和硼酸，0.06 mmol/L鹽酸和0.1 g/L氨芐青霉素鈉[22]。

生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：75 mmol/L N-乙酰葡萄糖胺(NAG)，50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)， 4 mmol/L MgSO4·7H2O，2 mmol/L氯化錳，25 g/L葡萄糖(Glc)，5 g/L硫酸銨[8]。

1.2 方法

1.2.1 基因組的提取

化膿鏈球菌、大腸桿菌和多殺巴氏桿菌CVCC408的基因組DNA采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取。

1.2.2 hasA和hasB基因的克隆

根據(jù)多殺巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶(Pasteurella multocida hyaluronan synthase)pmuhasA序列(GenBank Accession No.AF036004.2)，化膿鏈球菌Streptococcus pyogenes MGAS5005 spyhasB序列(GenBank Accession No.CP000017.1)和大腸桿菌Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655 ecohasB序列(GenBank Accession No.U00096.3)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物見表1。

分別以多殺巴氏桿菌、化膿鏈球菌和大腸桿菌的基因組DNA為模板，以表1對應(yīng)的上下游引物擴(kuò)增基因。PCR條件：95℃5 m in；95℃30 s，55℃30 s，72℃3 min共30個(gè)循環(huán)；72℃5 min。 PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用普通DNA回收試劑盒回收。

1.2.3 工程菌的構(gòu)建

質(zhì)粒的提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)操作均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[23]進(jìn)行。ecohasB的PCR產(chǎn)物，質(zhì)粒pRX2NdeⅠ/KpnⅠ雙酶切連接轉(zhuǎn)化；spyhasB的PCR產(chǎn)物，質(zhì)粒pRX2NdeⅠ/SacⅠ雙酶切連接轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆測序，鑒定正確的重組載體分別命名為pRXEB和pRXSB(圖1)。pmuhasA的PCR產(chǎn)物，質(zhì)粒pBAD NcoⅠ/SacⅠ雙酶切連接轉(zhuǎn)化；pmuhasA的PCR產(chǎn)物NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切，ecohasB的PCR產(chǎn)物Bam HⅠ/SacⅠ雙酶切，pBAD-HisB質(zhì)粒NcoⅠ/SacⅠ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化；pmuhasA的PCR產(chǎn)物NcoⅠ/Bam HⅠ雙酶切，spyhasB的PCR產(chǎn)物Bam HⅠ/SacⅠ雙酶切，pBAD-HisB質(zhì)粒NcoⅠ/SacⅠ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化；挑選陽性克隆測序，鑒定正確的重組載體分別命名為pBPA、pBPAEB和pBPASB(圖1)。

1.2.4 UGDH的表達(dá)純化

將重組質(zhì)粒pRXEB和pRXSB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，挑選單克隆，37℃培養(yǎng)過夜。按1%的接種量接種到自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(誘導(dǎo)物終濃度為2 g/L乳糖)，置于16℃，220 r/min下振蕩培養(yǎng)24 h。4℃、5 000 r/min，離心10 m in收集菌體。

菌體重懸到50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液中，經(jīng)超聲波破碎，4℃、10 000 r/m in離心30 m in，收集上清。上清用0.22 μm的濾膜過濾后通過FPLC用鎳柱純化。1 m L/m in流速上樣，含40 mmol/L咪唑的Tris-HCl(pH 8.0)洗脫雜蛋白，含250 mmol/L咪唑的Tris-HCl(pH 8.0)洗脫目的蛋白。目的蛋白于50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液中，4℃透析過夜。SDS-PAGE電泳檢測蛋白的純度。

1.2.5 UGDH的酶活測定[18]

反應(yīng)體系：100 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L DTT，10 mmol/L MgCl2，2 mmol/L UDP-glucose和1.5 mmol/L NAD，在340 nm處測OD值的增量。酶活定義：在一定的溫度和pH條件下，每分鐘反應(yīng)生成1 μmol NADH所需酶量為1個(gè)酶活力單位(μmol/m in)。酶活性計(jì)算公式：A(U)=1/ε*V總/V酶*ΔOD/Δt；V總和V酶分別代表酶活測定反應(yīng)體系的體積及酶液體積；ε為摩爾吸光系數(shù)6.22×10–3μmol–1cm–1。用Bradford法測蛋白含量，牛血清蛋白BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.6 UGDH的酶學(xué)性質(zhì)分析

1)pH對UGDH酶活力的影響及UGDH的pH穩(wěn)定性

最適pH：在室溫下分別于pH 7.0?11.0緩沖體系中測定UGDH樣品溶液的酶活力。pH穩(wěn)定性：UGDH樣品溶液分別在pH 3.0?11.0緩沖體系中，室溫下放置3 h，然后測定不同緩沖體系中剩余酶活力(其中pH 3.0?6.0為0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；pH 6.0?9.0為0.1 mol/LTris-HCl緩沖液；pH 9.0?11.0為0.1 mol/LGly-NaOH緩沖液)。

2)溫度對UGDH酶活力的影響及UGDH的熱穩(wěn)定性

最適溫度：在UGDH的最適反應(yīng)pH下，分別于16℃、20℃、30℃、37℃、45℃、55℃下測定UGDH樣品溶液的酶活力。熱穩(wěn)定性：UGDH樣品溶液分別于16℃、20℃、30℃、37℃、45℃、55℃下溫育3 h，在最適條件下測定樣品的剩余酶活力。

1.2.7 生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)HA

1)UGDH和HasA的表達(dá)

重組質(zhì)粒pBPA，pBPAEB和pBPASB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BW 25113中，挑選單克隆，37℃培養(yǎng)過夜。按1%的接種量接種到自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(誘導(dǎo)物終濃度為2 g/L阿拉伯糖)，37℃，220 r/m in振蕩培養(yǎng)13 h。4℃、5 000 r/min離心10 m in收集菌體。SDS-PAGE電泳檢測pmu HasA、eco HasB和spy HasB的蛋白表達(dá)情況。

2)HA的轉(zhuǎn)化

上述菌體(OD600為20)重懸于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，33℃，230 r/m in振蕩培養(yǎng)10 h，每隔3 h用氨水將轉(zhuǎn)化液中pH調(diào)至7.0。

3)HA的提取與測定

HA的提取采用Chung等[24]的方法和HA產(chǎn)量的測定采用Wen等的CTAB法[25]。

4)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

pH：6.0，6.5，7.0，7.5，8.0；溫度：24，29，33，37，42℃；NAG濃度：0，5，10，15，20，25 mmol/L；Glc濃度：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3%；表面活性劑0.05%CTAB，SDS，Tween80，Triton X-100。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

測序結(jié)果顯示：pmuhasA基因與報(bào)道的多殺巴氏桿菌透明質(zhì)酸合成酶(Pasteurella multocida hyaluronan synthase)pmhasA基因序列相似性99%，蛋白序列存在1個(gè)氨基酸差異，725位G→S；spyhasB基因與報(bào)道的化膿鏈球菌Streptococcus pyogenes MGAS5005 spyhasB基因序列相似性99%，蛋白序列存在1個(gè)氨基酸差異，400位N→G；ecohasB基因與報(bào)道的Escherichia coli str.K-12 substr.MG1655 ecohasB基因序列相似性100%。

2.2 UGDH的表達(dá)及純化

SDS-PAGE(圖2)分析表明，16℃誘導(dǎo)的eco HasB和spy HasB大部分以可溶形式存在于破碎后的上清中。eco HasB和spy HasB重組蛋白大小約為45 kDa。通過凝膠掃描系統(tǒng)分析，經(jīng)Ni柱純化后的eco HasB和spy HasB的純度在90%以上。

2.3 UGDH的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 pH對UGDH酶活力的影響及UGDH的pH穩(wěn)定性

圖3表明eco HasB和spy HasB的最適pH分別是9.0和10.0。UGDH的pH的穩(wěn)定性表明，eco HasB在pH 6.0最穩(wěn)定，pH 6?7下酶活力維持在70%以上。spy HasB在pH 7.0最穩(wěn)定，pH 7?9下酶活力能維持在80%以上，pH為9仍能維持70%的酶活力；表明spy HasB在偏堿性條件下比eco HasB更穩(wěn)定。

2.3.2 溫度對UDPG酶活力的影響及UDPG的熱穩(wěn)定性

圖4表明：eco HasB和spy HasB的最適反應(yīng)溫度均為30℃，UGDH的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，隨著溫度的升高，UGDH的活性緩慢下降，eco HasB和spy HasB在37℃以下溫育3 h后，酶活力均能維持在70%以上，而在45℃以上溫育3 h，酶活力幾乎全部消失。

圖2 重組eco HasB和spy HasB的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of pRXEB/BL21(DE3) andpRXSB/BL21(DE3).M:size markers(from top to bottom:200,150,120,100,85,70,60,50,40,30,25, 20,15,and 10 kDa);1:supernatant non-induced pRXEB/BL21(DE3);2:supernatant induced pRXEB /BL21(DE3);3:purified fusion eco HasB about 45 kDa; 4:supernatant non-induced pRXSB/BL21(DE3);5: supernatant induced pRXSB/BL21(DE3);6:purified fusion spy HasB about 45 kDa.

圖3 pH對酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on enzyme activity.

圖4 溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity.

2.4 UGDH和HasA的表達(dá)

SDS-PAGE(圖5)分析表明，泳道2，3，4中pmu HasA均得到了蛋白表達(dá)大小約為106 kDa。泳道3，4中eco HasB和spy HasB均得到蛋白表達(dá)大小約為45 kDa，eco HasB比spy HasB蛋白表達(dá)量大。

2.5 生物轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

在不同條件下，對pBPAEB/BW 25113和pBPASB/BW 25113的HA產(chǎn)量進(jìn)行分析。如圖6A所示：pH 7.5時(shí)，HA的產(chǎn)量最高，生物轉(zhuǎn)化液在pH 7.0?8.0之間，HA的產(chǎn)量均能達(dá)到1 g/L以上。當(dāng)pH＜7時(shí)，HA的產(chǎn)量明顯下降；如圖6B所示，在33℃，HA的產(chǎn)量最高；如圖6C所示，NAG的濃度為20 mmol/L HA產(chǎn)量最高，通過HPLC測定分析發(fā)現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化10 h后，NAG依然有剩余；如圖6D所示，在NAG濃度為0時(shí)，Glc的濃度為2%HA產(chǎn)量最高，通過SBA生物傳感分析儀測定生物轉(zhuǎn)化10 h后，Glc仍然過剩；表面活性劑對生物轉(zhuǎn)化的影響：0.05%Tween80對HA的生產(chǎn)有促進(jìn)作用，而0.05%TritonX-100、0.05%SDS、0.05%CTAB對HA的生產(chǎn)有抑制作用；優(yōu)化后HA轉(zhuǎn)化的條件為20 mmol/L NAG，2%Glc，0.05%Tween 80，pH 7.5，33℃。

圖5 HasA和HasB的共表達(dá)SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of co-expression HasA and HasB.M:size markers(from top to bottom:200, 150,120,100,85,70,60,50,40,30,25,20,15 and 10 kDa);1:induced pBAD-HisB/BW 25113;2:induced pBPA/BW 25113;3:induced pBPAEB/BW 25113;4: induced pBPASB/BW 25113.

圖6 不同條件對HA產(chǎn)量的影響(A：pH；B：溫度；C：NAG；D：G lc)Fig.6 Effect of different conditions on HA production.(A)pH.(B)Temperature.(C)NAG.(D)Glc.

2.6 UDP-葡萄糖脫氫酶的酶學(xué)性質(zhì)對透明質(zhì)酸產(chǎn)量的影響

eco HasB和spy HasB酶學(xué)性質(zhì)比較發(fā)現(xiàn)spy HasB比eco HasB酶比活力更高，更穩(wěn)定。eco HasB在25℃，pH 9.0條件下，粗酶比活力是0.32 U/mg，在30℃，pH 9.0條件下，純酶比活力是5.55 U/mg；spy HasB在25℃，pH 10.0條件下粗酶比活力是0.44 U/mg，在30℃，pH 10.0條件下，純酶比活力是12.2 U/mg。在初始生物轉(zhuǎn)化條件下，重組菌pBAD-HisB/BW 25113和pBPA/BW 25113沒有檢測到HA；重組菌pBPAEB/BW 2513和pBPASB/BW 25113 HA產(chǎn)量分別為1.15和1.29 g/L。生物轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，菌株pBPAEB/BW 2513和pBPASB/BW 25113HA產(chǎn)量提高到了1.52和1.7 g/L，兩株重組菌HA的產(chǎn)量均提高了30%以上。研究表明：HasB越穩(wěn)定，比活力越高，生物轉(zhuǎn)化生成的HA產(chǎn)量越高。

3 討論

UGDH在生物體許多過程中是必需的。UGDH催化的產(chǎn)物UDP-GlcA是形成結(jié)構(gòu)多糖和細(xì)胞生長代謝必不可缺的前體物質(zhì)[26-27]。2013年，陳奕涵等[19]用嚴(yán)格控制的溫敏型轉(zhuǎn)錄強(qiáng)啟動(dòng)子PL誘導(dǎo)e co HasB的表達(dá)，38℃下誘導(dǎo)6 h后酶活力達(dá)到了14 U/mg，但10 h后降低到4 U/mg。表明eco HasB很難長時(shí)間在細(xì)胞內(nèi)保持較高的活性，而本研究重組表達(dá)的eco HasB 37℃以下，pH為6的緩沖液中比較穩(wěn)定。1993年，Dougherty等[20]，37℃下，在大腸桿菌JM 109(DE3)中表達(dá)了spy HasB。在30℃下測定的酶比活分別是1.51和3.71 U/mg(兩次平行實(shí)驗(yàn))。而本文重組表達(dá)的spy HasB比活力是Dougherty等表達(dá)的spy HasB的3倍。eco HasB和spy HasB的比活力高于海洋真菌草莖點(diǎn)霉YS4108[17]，鞘氨醇單胞菌[18]和超嗜熱古菌-冰島熱棒菌[16]的UDP-葡萄糖脫氫酶的比活力。兩者的酶學(xué)性質(zhì)比較分析表明，spy HasB粗酶和純酶的比活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于eco HasB(圖2)，但是在大腸桿菌中的表達(dá)量不如eco HasB。通過大腸桿菌的稀有密碼子分析發(fā)現(xiàn)，spyhasB基因中含有大量的稀有密碼子，可以通過密碼子優(yōu)化提高spy HasB的表達(dá)量，提高spy HasB的胞內(nèi)比活。

UGDH是HA合成的關(guān)鍵酶，對HA的生產(chǎn)有重要影響。在HA生產(chǎn)的過程中，穩(wěn)定性好、酶活力高的UGDH能提高HA的產(chǎn)量。HA生物轉(zhuǎn)化過程中，Glc和NAG是HA積累的原料，當(dāng)NAG濃度為0時(shí)，pBPAEB/BW 2513和pBPASB/BW 25113HA的產(chǎn)量分別為0.7和0.9 g/L，添加20 mmol/LNAG之后產(chǎn)量提高到1.2和1.5 g/L (圖6C)，這是因?yàn)樵诖竽c桿菌中，通過Glc合成UDP-NAG需要經(jīng)過復(fù)雜的過程，同時(shí)與HA的另一個(gè)前體物質(zhì)UDP-GlcA的合成存在競爭關(guān)系[12]。當(dāng)Glc、NAG過量時(shí)，大腸桿菌轉(zhuǎn)化液中會(huì)大量產(chǎn)酸，從而導(dǎo)致環(huán)境中pH降低，抑制HA的積累(圖6D)，pH對HA的轉(zhuǎn)化表明：在pH 7?8時(shí)，HA產(chǎn)量高，在pH＜7時(shí)，HA可能降解。溫度對HA的轉(zhuǎn)化表明：在33℃，HA的產(chǎn)量最高。這是因?yàn)閜BPAEB/BW 2513、pBPASB/BW 25113的生長和UDPG的酶活性對HA產(chǎn)量均有影響，并且大腸桿菌的最適生長溫度是37℃，UDPG的最適反應(yīng)溫度是30℃，且在37℃以下更穩(wěn)定(圖4)。有關(guān)研究表明不同的表面活性劑對HA轉(zhuǎn)化有不同的影響[28]。表面活性劑對HA的轉(zhuǎn)化表明：高濃度離子型的CTAB、SDS對HA的積累起到抑制作用，這和溫琦等[29]的結(jié)果是一致的。Tween80對HA的積累有促進(jìn)作用，這可能是因?yàn)楦淖兞思?xì)胞外基質(zhì)的狀態(tài)，細(xì)胞表面結(jié)合的HA降解[29]。

本文通過生物轉(zhuǎn)化重組菌株pBPAEB/BW 2513和pBPASB/BW 25113 HA產(chǎn)量達(dá)到了1.5和1.7g/L。與M ao等[13]在大腸桿菌JM 109中搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)的HA(0.5 g/L)相比提高了3倍；與Yu等[12]在大腸桿菌中發(fā)酵生產(chǎn)的HA(0.19g/L)相比提高了近7倍；與Prasad等[9]在重組乳酸菌中發(fā)酵生產(chǎn)的HA(1.8g/L)相差不大；與Widner等[10]在重組枯草芽胞桿菌(1 g/L)，Kotra等[7]在獸醫(yī)鏈球菌(1.38g/L)，Naoki等[11]在嗜熱鏈球菌(1.2 g/L)產(chǎn)生的HA相比，產(chǎn)量有不同程度的提高。在HasA和HasB共表達(dá)蛋白過程中采用了阿拉伯糖誘導(dǎo)的弱啟動(dòng)子，避免UGDH表達(dá)過快形成包涵體；通過采用生物轉(zhuǎn)化的方法生產(chǎn)HA，將細(xì)菌培養(yǎng)、蛋白表達(dá)和HA轉(zhuǎn)化分步進(jìn)行，以降低對菌體生長的抑制。本研究表明利用大腸桿菌作為宿主菌生產(chǎn)HA具有一定的優(yōu)勢，并且為運(yùn)用生物轉(zhuǎn)化工藝大規(guī)模生產(chǎn)HA提供了幫助。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Effects of two UDP-glucose dehydrogenases on hyaluronic acid biotransformation

Donghui Guo1,Jian Han2,Weifeng Liu2,Zhenzhou Fu2,Qizhong Zhu1,and Yong Tao2
1 Marine College,Shandong University,Weihai 264209,Shandong,China 2 Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China

We amplified genes encoding UDP-glucose dehydrogenase,ecohasB from Escherichia coli and spyhasB fromStreptococcus pyogenes.Both ecohasB and spyhasB were inserted into T7 expression vector pRX2to construct recombinant plasm ids pRXEB and pRXSB,and to express in E.coli BL21(DE3).A fter nickel column purification of UDP-glucose dehydrogenases,the enzymes were characterized.The optimum reaction condition of spy HasB was at 30℃and pH 10.The specific activity reached 12.2 U/mg under optimum condition.The optimum reaction condition of eco HasB was at 30℃and pH 9.Its specific activity reached 5.55 U/mg under optimum condition.The pmuhasA gene encoding hyaluronic acid synthase was amplified from Pasteurella multocida and ligated w ith ecohasB and spyhasB to construct the coexpression vectors pBPAEB and pBPASB,respectively.The co-expression vectors were transformed into E.coli BW 25113. Hyaluronic acid(HA)was produced by biotransformation and the conditions were optim ized.When recombinant strains were used to produce hyaluronic acid,the higher the activity of UDP-glucose dehydrogenase was,the better its stability was,and the higher the HA production could reach.Under the optimal conditions,the yields of HA produced by pBPAEB/BW 25113 and pBPASB/BW 25113 in shake flasks were 1.52 and 1.70 g/L,respectively,and the production increased more than 2?3 folds as previously reported.

UDP-glucose dehydrogenase,enzyme characterization,hyaluronic acid,biotransformation

March 10,2014;Accep ted:May 5,2014

郭東會(huì),韓劍,劉偉豐,等.兩種UDP-葡萄糖脫氫酶對透明質(zhì)酸生物轉(zhuǎn)化的影響.生物工程學(xué)報(bào),2014,30(11):1691?1700.

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