來氟米特對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠T細(xì)胞亞群及Th1型細(xì)胞因子的影響

袁正洲，李作孝，馬勛泰，羅斌，胡高云，楊波，陳琪

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科1、介入科2、肝膽外科3，四川瀘州 646000)

來氟米特對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎小鼠T細(xì)胞亞群及Th1型細(xì)胞因子的影響

袁正洲1，李作孝1，馬勛泰1，羅斌2，胡高云2，楊波2，陳琪3

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科1、介入科2、肝膽外科3，四川瀘州 646000)

目的探討來氟米特(Leflunom ide，LEF)對(duì)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型發(fā)病防治作用及可能的免疫學(xué)機(jī)制。方法將30只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為EAE對(duì)照組及高、低劑量LEF防治組，每組10只。通過注射髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55(MOG35-55)免疫介導(dǎo)構(gòu)建EAE模型。從造模前3 d開始起EAE對(duì)照組及高、低劑量LEF防治組分別予以生理鹽水8mg/(kg·d)、LEF 2mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)10 d。觀察小鼠發(fā)病情況及外周血中T細(xì)胞亞群及IFN-γ、IL-2水平的變化。結(jié)果LEF各防治組小鼠臨床癥狀較輕，發(fā)病高峰期外周血T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+分布比例較EAE對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，CD4+/CD8+值明顯降低(P＜0.01)；發(fā)病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量較EAE對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)，且高劑量降低更明顯(P＜0.01)。結(jié)論LEF對(duì)EAE具有防治作用，效果與LEF劑量有關(guān)，其防治作用可能與調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群分布及抑制IFN-γ、IL-2水平有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；多發(fā)性硬化；來氟米特；T細(xì)胞亞群；Th1型細(xì)胞因子

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Centralnervous system，CNS)不同部位及不同程度白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病[1]?；颊叽蠖噙z留不同程度的后遺癥而影響生活質(zhì)量。來氟米特(Leflunom ide，LEF)是人工合成的嗯唑類化合物，作為一種新型的免疫抑制劑最早應(yīng)用于器官移植[2]。LEF也已用于自身免疫性疾病的治療，除對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效顯著外，在全身性紅斑狼瘡、腎小球疾病、皮膚疾病等治療中也取得了較好的治療療效，且藥物不良反應(yīng)較小[3]。目前國內(nèi)外未見其用于防治MS及其動(dòng)物模型EAE的報(bào)道。本研究探討LEF對(duì)MS的動(dòng)物模型EAE是否具有防治作用及其對(duì)T細(xì)胞亞群及Th1型細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性C57BL/6小鼠30只，6～8周齡，體重(20±2)g，購自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，為一級(jí)合格動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)前在瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑來氟米特片(LEF)購自蘇州長征-欣凱制藥有限公司。髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成，純度＞95%；福氏不完全佐劑(IFA)購自Sigma公司；百日咳毒素(PTx)購自A lexis公司；結(jié)核分枝桿菌H37Ra(MT)購自BD公司。T細(xì)胞亞群檢測試劑盒(FITC-CD4/PE-CD8)購自COULTER公司；細(xì)胞因子IL-2ELISA檢測試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；IFN-γELISA試劑盒購自晶美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 EAE模型制作小鼠通過隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為三組：EAE對(duì)照組及高、低劑量LEF防治組，每組10只。將MOG35-55及結(jié)核分枝桿菌H37Ra (MT)溶解于IFA中制成免疫抗原，其中每毫升抗原含1mg MOG35-55及4mg結(jié)核分枝桿菌。在小鼠后背中線兩側(cè)分四點(diǎn)注入免疫抗原，每只注入0.2m l。在造模后當(dāng)天及第2天，每只小鼠腹腔注射PTx 200 ng加強(qiáng)免疫反應(yīng)。

1.3.2 模型干預(yù)從造模前3 d開始起每天高、低劑量LEF組分別予以LEF片8mg/(kg·d)、2mg/(kg·d) (用2m l注射用生理鹽水溶解)灌胃；EAE對(duì)照組每日2m l生理鹽水灌胃，連續(xù)10 d。

1.3.3 動(dòng)物模型評(píng)價(jià)每日定時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)C57BL/6小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，未發(fā)??；1分，后肢輕度無力(包括尾巴無力)；2分，中度后肢無力或者輕度共濟(jì)失調(diào)；3分，中至重度后肢無力；4分，嚴(yán)重后肢無力；5分，中度以下四肢無力的截癱；6分，四肢全癱或嚴(yán)重共濟(jì)失調(diào)或者死亡[4]。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)終止C57BL/6小鼠在發(fā)病高峰期(連續(xù)3 d癥狀評(píng)分無加重、四肢癱瘓或死亡時(shí))處死，實(shí)驗(yàn)終止時(shí)取小鼠心臟動(dòng)脈血2m l。

1.3.5 IL-2、IFN-γ水平及T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+測定ELISA法測IFN-γ、IL-2含量，按照說明書操作，通過標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線再計(jì)算各樣本值。流式細(xì)胞儀測定外周血T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+分布。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)數(shù)資料采用率描述。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較，符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，方差不齊或非正態(tài)分布時(shí)采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)(Kruskal-WallisH test)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由SPSS19.0軟件包分析完成。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAE對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病潛伏期、進(jìn)展期及臨床表現(xiàn)C57BL/6小鼠造模后主要表現(xiàn)為精神萎靡、活動(dòng)減少、食欲減弱、體重下降等。注射抗原17 d左右，EAE小鼠逐漸出現(xiàn)單后肢或雙后肢或伴前肢不同程度的無力、共濟(jì)失調(diào)、癱瘓；而高、低劑量LEF組癥狀較EAE對(duì)照組明顯減輕，表現(xiàn)為潛伏期天數(shù)延長、進(jìn)展期縮短、神經(jīng)功能障礙評(píng)分降低(P＜0.01或P＜0.05)，高劑量改善更明顯(P＜0.01或P＜0.05)，見表1。

表1 EAE對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病潛伏期和進(jìn)展期比較(±s)

表1 EAE對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病潛伏期和進(jìn)展期比較(±s)

注：與EAE對(duì)照組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與小劑量LEF防治組比較，cP＜0.01，dP＜0.05。

組別神經(jīng)功能障礙評(píng)分(分)例數(shù)潛伏期(d)進(jìn)展期(d) EAE對(duì)照組低劑量LEF防治組高劑量LEF防治組H值P值4.22±1.13 3.45±1.33a3.05±0.75ad5.31＜0.01 10 10 10＜0.05 17.15±1.75 18.42±1.31b19.67±1.43ad5.62＜0.01 5.22±1.41 4.68±1.55b3.65±1.19ac6.74＜0.01

2.2 EAE對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病高峰期T細(xì)胞亞群分布變化LEF各防治組發(fā)病高峰期外周血T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+分布比例較EAE對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，CD4+/CD8+值明顯降低(P＜0.01)；高劑量LEF防治組大鼠發(fā)病高峰期外周血CD4+、CD8+分布比例較低劑量LEF組明顯增高(P＜0.01)，CD4+/CD8+值降低不明顯(P＞0.05)，見表2。

表2 EAE對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病高峰期T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+值(±s)

表2 EAE對(duì)照組及LEF各防治組發(fā)病高峰期T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+值(±s)

注：與EAE對(duì)照組比較，aP＜0.01；與小劑量LEF防治組比較，bP＜0.01，cP＜0.05。

組別CD4+/CD8+例數(shù)CD4+(%)CD8+(%) EAE對(duì)照組低劑量LEF防治組高劑量LEF防治組H值P值2.57±0.04 1.88±0.11a1.86±0.09ac215.55＜0.01 10 10 10＜0.01 35.49±0.58 40.68±1.24a43.87±1.04ab226.11＜0.01 13.81±0.23 21.75±1.28a23.58±0.81ab428.88＜0.01

2.3 EAE對(duì)照組及LEF各防治組C57BL/6小鼠發(fā)病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量變化LEF各防治組發(fā)病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量較EAE對(duì)照組明顯降低(P＜0.01)；高劑量LEF防治組C57BL/6小鼠發(fā)病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量較低劑量LEF防治組低(P＜0.01)，見表3。

表3 EAE對(duì)照組及LEF各防治組C57BL/6小鼠發(fā)病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量變化(±s)

表3 EAE對(duì)照組及LEF各防治組C57BL/6小鼠發(fā)病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量變化(±s)

注：與EAE對(duì)照組比較，aP＜0.01；與小劑量LEF防治組比較，bP＜0.01。

組別INF-γ(ng/m l)例數(shù)IL-2(ng/m l) EAE對(duì)照組低劑量LEF防治組高劑量LEF防治組H值P值15.14±1.10 12.77±0.51a11.42±0.86ab56.17＜0.01 10 10 10 23.37±1.19 13.96±1.18a9.45±0.52ab137.32＜0.01

3 討論

MS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，是遺傳易患個(gè)體與環(huán)境因素相互作用而發(fā)生的自身免疫所介導(dǎo)的疾病。MS患者具有多個(gè)異常的免疫環(huán)節(jié)，包括自身抗體破壞髓鞘以及自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活，同時(shí)MS患者腦脊液、外周血以及腦組織中出現(xiàn)多種活化反應(yīng)性T細(xì)胞。自20世紀(jì)中葉，Kabat等在成功地造出MS的動(dòng)物模型EAE以來，EAE造模動(dòng)物發(fā)展種類繁多，猴、大鼠、C57BL/6小鼠等均有報(bào)道[5]。C57BL/6小鼠是用來建立MS模型的理想品系，但由于其價(jià)格較高，且造模過程中抗原及百日咳毒素價(jià)格不菲同時(shí)不易獲取，國內(nèi)較少使用，而國際上普遍采用C57BL/6小鼠構(gòu)建穩(wěn)定的模型[6]。

LEF是美國FDA批準(zhǔn)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療的一種新型免疫抑制劑。作為一種新型的免疫抑制劑最早應(yīng)用于器官移植，LEF同時(shí)也已用于自身免疫性疾病的治療[7]。LEF通過抑制抑制淋巴細(xì)胞活化及由此而致的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)選擇8mg/(kg·d)、2mg/(kg·d)兩種劑量LEF對(duì)EAE小鼠進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)LEF通過發(fā)揮其抗炎功能，能夠延長EAE發(fā)病潛伏期、縮短進(jìn)展期、減輕神經(jīng)功能障礙評(píng)分，對(duì)EAE有保護(hù)作用且劑量依賴關(guān)系作用效果明顯。

在MS的諸多發(fā)病機(jī)制中，由于體內(nèi)免疫平衡被打破，從而引發(fā)的自身免疫性疾病被認(rèn)為是最重要的一種機(jī)制[8]。T淋巴細(xì)胞參與細(xì)胞免疫的，根據(jù)T淋巴細(xì)胞表面的抗原不同可分為CD4+以及CD8+兩類細(xì)胞[9]。T細(xì)胞在脫髓鞘中起重要作用，在MS患者腦組織病灶中發(fā)現(xiàn)大量的CD4+和CD8+T細(xì)胞，在有針對(duì)性地去除EAE大鼠的CD4+Th細(xì)胞后，EAE大鼠病情有所緩解乃至恢復(fù)正常[10]。如果去除了大鼠的CD4+T細(xì)胞，則可以導(dǎo)致大鼠對(duì)EAE產(chǎn)生抵抗。對(duì)猴實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎血和腦脊液T淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，急性期猴EAE血中CD4+/CD8+明顯升高，猴EAE發(fā)病后腦脊液CD4+T細(xì)胞在急性期比血中CD4+T細(xì)胞升高更明顯，CD4+/CD8+明顯比發(fā)病前高，證實(shí)了EAE是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)為主的免疫紊亂。推測EAE發(fā)病時(shí)存在CD4+T、CD8+T等免疫活性細(xì)胞增殖能力下降：EAE動(dòng)物存在T細(xì)胞亞群分布異常、CD4+/CD8+值倒置。本研究結(jié)果顯示：EAE組發(fā)病高峰期外周血T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+分布比例較LEF防治組明顯降低，CD4+/CD8+值明顯增高。提示EAE發(fā)病與CD4+、CD8+分布比例降低、CD4+/CD8+值增高有關(guān)。LEF可能通過提高EAE大鼠CD4+、CD8+分布比例和降低CD4+/CD8+值，糾正T細(xì)胞亞群分布異常從而發(fā)揮對(duì)EAE的保護(hù)作用。其保護(hù)作用與劑量有關(guān)，高劑量作用更為明顯。

根據(jù)其分泌不同的細(xì)胞因子，CD4+T細(xì)胞又被分為Thl、Th2等細(xì)胞。Thl細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等。通常情況下，機(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞因子較少，在受到抗原、細(xì)胞因子以及內(nèi)毒素等刺激后能夠迅速產(chǎn)生大量細(xì)胞因子[11]。有研究顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的IL-2 mRNA及蛋白在EAE在恢復(fù)期降低，而在誘導(dǎo)期以及急性期增高。用基因敲除IL-2的C57BL/6小鼠來造EAE模型，實(shí)驗(yàn)顯示未敲除的野生型小鼠全部發(fā)病，而敲除IL-2的小鼠僅有23%的造模成功率[12]。證實(shí)了IL-2缺乏的C57BL/6小鼠對(duì)EAE易感性下降。IFN-γ協(xié)同TNF-α上調(diào)星形細(xì)胞對(duì)MHCII類分子的表達(dá)，促進(jìn)抗原遞呈，加速炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)。本研究發(fā)現(xiàn)LEF各防治組發(fā)病高峰期外周血IL-2、INF-γ含量較EAE對(duì)照組明顯降低，高劑量LEF防治組外周血IL-2、INF-γ含量較低劑量LEF防治組低，與既往研究結(jié)果相似。

綜上所述，LEF能夠延長EAE發(fā)病潛伏期、縮短進(jìn)展期、減輕神經(jīng)功能障礙評(píng)分，對(duì)EAE具有保護(hù)作用，且劑量依賴關(guān)系作用效果明顯。其保護(hù)作用可能與提高EAE大鼠CD4+、CD8+分布比例和降低CD4+/ CD8+值，糾正T細(xì)胞亞群分布異常以及降低Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ有關(guān)。LEF為防治MS提供了新的研究方向，而其在MS患者中的安全有效性還有待于進(jìn)一步研究。

[1]Valera P,Zavattari P,Albanese S,etal.A correlation study between multiple sclerosis and type 1 diabetes incidences and geochemical data in Europe[J].Environmental Geochemistry and Health,2013, 25(4):1-20.

[2]W iacek R,Kolossa K,Jankow ski T,etal.The efficacy and safety of leflunom ide in patients w ith active rheumatoid arthritis[J].Adv Clin Exp M ed,2012,21(3):337-342.

[3]Chen XC,Liu T,Li JJ,etal.Efficacy and safety of leflunomide for the treatmentof BK virus-associated hemorrhagic cystitis in Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation recipients[J].ActaHaematologica,2013,130(1):52-56.

[4]Brod SA,Hood ZM.Ingested(oral)SST inhibits EAE[J].Autoimmunity,2011,44(5):437-443.

[5]Stepanov AV,Belogurov AA,Mamedov AE,et al.Therapeutic effectof encapsulated into the nanocontainers MBPimmunodominant peptideson EAE developmentin DA rats[J].Bioorganicheskaia Khimiia,2012,38(3):306-314.

[6]M a X,Jiang Y,W u A,et al.Berberine attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in C57 BL/6m ice[J].PloSOne,2010,5 (10):1-10.

[7]Ren Q,Zeng HS,Zeng XFL.Leflunom ide inhibits the apoptosis of human embryonic lung fibroblasts infected by human cytomegalovirus[J].Eur JMed Res,2013,18:3.

[8]Zhang Y,Guo T B,Lu H.Promoting remyelination for the treatment ofmultiple sclerosis:opportunities and challenges[J].Neuroscience Bulletin,2013,29(2):144-154.

[9]Jiang H,Braunstein NS,Yu B,etal.CD8+T cells control the TH phenotype of MBP-reactive CD4+T cells in EAE m ice[J].Proc Natl Acad SciUSA,2001,98(11):6301-6306.

[10]Bettini M,Rosenthal K,Evavold BD.Pathogenic MOG-reactive CD8+T cells require MOG-reactive CD4+T cells for sustained CNS inflammation during chronic EAE[J].Journal of Neuroimmunology,2009,213(1-2):60-68.

[11]Mannie MD,Clayson BA,Buskirk EJ,etal.IL-2/neuroantigen fusion proteins as antigen-specific tolerogens in experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE):correlation of T cell-mediated antigen presentation and tolerance induction[J].Journal of Immunology,2007,178(5):2835-2843.

[12]Webster KE,Walters S,Kohler RE,et al.In vivo expansion of T reg cells w ith IL-2-mAb complexes:induction of resistance to EAE and long-term acceptanceof isletallograftsw ithoutimmunosuppression[J].JEXPM ed,2009,206(4):751-760.

Effect of leflunom ide on Tcell subsetsand Th1-type cytokines in experimental allergic encephalom yelitism ice.

YUAN Zheng-zhou1,LIZuo-xiao1,MAXun-tai1,LUO Bing2,HU Gao-yun2,YANG Bo2,CHEN Qi3.Departmentof Neurology1,Department of Interventional Therapy2,Department of Hepatobiliary Surgery3,the Affiliated Hospital of Luzhou MedicalCollege,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA

Objective To investigate the effectof leflunom ide(LEF)on experimental allergic encephalomyelitis(EAE)m ice and the possible immunologicalmechanism s.MethodsThirty female C57BL/6m icewere randomly divided into EAE control group,high and low dose leflunom ide treatment group,w ith n=10 in each group.EAE model w as built by injection of myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55(MOG35-55).From three days before modeling,the control group,the high dose treatment group,and low dose treatmentgroup were feed saline,leflunomide 8mg/(kg·d),leflunomide2mg/(kg·d)for 10 days,respectively.Incidencewas observed inm ice and peripheral blood T cell subsets and IFN-γ,IL-2 levelswere detected.ResultsEach treatment group havemild clinical symptoms,and peripheral blood T cell subsets CD4+,CD8+distribution rateswere significantly higher than EAE control group(P＜0.01),while CD4+/CD8+valuewas lower(P＜0.01).The peripheralblood IL-2,INF-γlevels in high and low dose treatmentgroup were significantly lower than EAE control group(P＜0.01),and the reduction in high dose treatment group wasmore significant(P＜0.01).ConclusionLeflunom ide has preventive effect on EAE,and the effect is dose related w ith the leflunom ide.Its preventive effectmay be related to the regulation of T lymphocyte subsets and inhibition of IFN-γ,IL-2.

Experimental allergic encephalomyelitis;Multiple sclerosis;Leflunom ide;T cell subsets;Th1 type cytokines

R-332

A

1003—6350(2014)04—0480—04

2013-10-28)

瀘州市科技創(chuàng)新苗子培育計(jì)劃項(xiàng)目[編號(hào)：2013-R-51(8/18)]

李作孝。E-mail：lzx3235@sina.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0186