TIP30基因表達(dá)對吉非替尼體內(nèi)抑瘤作用的影響研究

陳錦章，黃維，鄭大勇，阮健，陳逢生，李愛民

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東廣州 510515；2.順德第一人民醫(yī)院腫瘤科，廣東順德 528300)

TIP30基因表達(dá)對吉非替尼體內(nèi)抑瘤作用的影響研究

陳錦章1，黃維2，鄭大勇1，阮健1，陳逢生1，李愛民1

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，廣東廣州 510515；2.順德第一人民醫(yī)院腫瘤科，廣東順德 528300)

目的探討TIP30基因的表達(dá)與吉非替尼體內(nèi)抑瘤作用的相關(guān)性。方法選取小鼠24只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組12只。兩組小鼠均經(jīng)皮下種植肺癌細(xì)胞獲得腫瘤模型，實(shí)驗(yàn)組通過沉默TIP30基因建立TIP30低表達(dá)模型，對照組裸鼠則不作任何處理，利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法檢測兩組TIP30基因的表達(dá)情況。對兩組小鼠未用吉非替尼10mg/d進(jìn)行處理，15 d后觀察兩組小鼠的體內(nèi)腫瘤抑制程度。結(jié)果成功建立小鼠肺癌模型，實(shí)驗(yàn)組TIP30表達(dá)情況顯著低于對照組，兩組表達(dá)情況比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。對兩組小鼠利用吉非替尼進(jìn)行處理后，在第5天兩組的瘤體平均重量未見顯著差異，但第7天及第15天實(shí)驗(yàn)組瘤體重量顯著低于對照組(P＜0.05)，病理切片顯示實(shí)驗(yàn)組腫瘤抑制效果明顯強(qiáng)于對照組。結(jié)論TIP30基因?qū)翘婺岬捏w內(nèi)抑瘤作用具有促進(jìn)作用。

TIP30；肺癌；表皮生長因子受體；體內(nèi)研究

近年來，我國的肺癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，對肺癌進(jìn)行進(jìn)一步的診斷和治療顯得尤為重要[1]。目前靶向藥物治療肺癌發(fā)展較為迅速，其中表酪氨酸蛋白激酶抑制劑——表皮生長因子受體(Epithelial grow th factor receptor，EGFR)在非小細(xì)胞肺癌的治療中起著重要的作用[2]。TIP30是一種抑癌基因，最近幾年研究表明其在多種腫瘤組織中表達(dá)均較正常組織有所下調(diào)，且敲除TIP30基因，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[3-4]。有報(bào)道[5]TIP30在肺癌組織中的亦稱低表達(dá)，但TIP30的表達(dá)情況與吉非替尼的抑瘤作用相關(guān)研究筆者未見報(bào)道。我們2012年10月通過肺癌的動物模型對TIP30的表達(dá)與吉非替尼抑瘤作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞采用C57BL/6N的近交系小鼠24只，體重為18～22 g，鼠齡約8周，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，各12只。由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；肺癌細(xì)胞株由上海撫生試劑公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物吉非替尼由AstraZeneca(英國)公司提供，1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自Hy-clone公司，PCR試劑盒購自Boeh-ringer公司、引物和DNA片段購自上海博亞有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌小鼠動物模型的建立采用慢病毒載體干擾實(shí)驗(yàn)組的內(nèi)源性TIP30表達(dá)，采用Western blot及Qt-PCR定量檢查TIP30基因的表達(dá)情況，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因呈低表達(dá)狀態(tài)，之后將在體外進(jìn)行培養(yǎng)后處在對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，并接種到小鼠皮下，部位選取右前肢，接種濃度為每只107個(gè)細(xì)胞。觀察皮下腫瘤生長情況。兩組小鼠分別于給藥后5 d、7 d及15 d各處死4只，將所得組織進(jìn)行重量的計(jì)算并行統(tǒng)計(jì)分析，之后進(jìn)行病理切片檢查。

1.2.2 病理學(xué)檢查各組小鼠進(jìn)行解剖獲得腫瘤組織，通過10%福爾馬林固定后，采用石蠟包埋、切片，進(jìn)行依紅-蘇木精染色。成片后在光鏡下進(jìn)行腫瘤組織的觀察，評價(jià)不同用藥時(shí)間后的腫瘤惡性程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0進(jìn)行分析，兩組大鼠的瘤體重量比較采用t檢驗(yàn)。由于數(shù)據(jù)較少，且Rt-PCR定量數(shù)據(jù)和瘤體平均重量呈非正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)作圖采用Graphpad 5.0進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 兩組TIP30表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)組大鼠經(jīng)基因沉默方法對TIP30基因進(jìn)行沉默，各組隨機(jī)取一只大鼠進(jìn)行靶向基因表達(dá)檢測。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參進(jìn)行Western Blot檢測，結(jié)果顯示TIP30在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)量顯著少于對照組(圖1)，且Rt-PCR結(jié)果也顯示上述差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，圖2)。

圖1 實(shí)驗(yàn)組大鼠沉默TIP30基因后TIP30表達(dá)情況

圖2 RT-PCR檢測兩組細(xì)胞中TIP30水平差異情況

2.2 兩組吉非替尼處理后效果兩組大鼠均接受吉非替尼10mg/d處理后15 d觀察瘤體組織顯示，實(shí)驗(yàn)組瘤體縮小程度顯著強(qiáng)于對照組(圖3)。

圖3 兩組大鼠接受吉非替尼處理15 d后瘤體組織比較

2.3 兩組大鼠病理結(jié)果比較在第5天、第7天及第15天對瘤體組織進(jìn)行病理切片檢查，均見實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞情況顯著較對照組差(圖4)。兩組大鼠瘤體平均重量在第5天未見明顯差異(t=0.30，P=0.77)，而在第7天(t=3.64，P＜0.01)及第15天(t=4.66，P＜0.01)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

圖4 兩組大鼠在接受吉非替尼第5、7、15天的病理切片比較

圖5 兩組大鼠在接受吉非替尼第5、7、15天的瘤體平均重量

3 討論

早期轉(zhuǎn)移時(shí)肺癌的一大特征，也是肺癌患者治療失敗的主要原因之一。雖然目前已有眾多的臨床治療手段，但至今肺癌的5年存活率仍較低[6]，在全世界各癌癥的死亡人數(shù)中比例約高達(dá)17%[7]。故對于肺癌的早期治療和新型治療方法的探討具有重大意義。目前隨著分子生物學(xué)信號通路的研究，生物靶向治療在臨床上越來越受到重視[8]。其中在肺癌的臨床治療上較為成功的即為EGFR相關(guān)基因的突變與肺癌發(fā)生的研究，而TIP30蛋白屬于新型腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制基因，文獻(xiàn)顯示它與EGFR之間具有一定聯(lián)系[9]。對于該基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)對EGFR靶向治療藥的效果是否具有增強(qiáng)或抑制作用尚未見有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

我們本次研究通過構(gòu)建TIP30基因低表達(dá)肺癌的動物模型，采用EGFR抑制劑吉非替尼對TIP30正常的肺癌模型組合低表達(dá)TIP30基因的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行了干預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠TIP30基因呈低表達(dá)，而兩組在接受吉非替尼處理后，第5天兩組的瘤體重量未見明顯差異，而實(shí)驗(yàn)組第7天及第15天兩組的瘤體重量減少程度均明顯大于對照組小鼠。病理切片仍證實(shí)了隨著時(shí)間變化，實(shí)驗(yàn)組的抑瘤效果明顯強(qiáng)于對照組。

TIP30屬于一種腫瘤抑制基因，文獻(xiàn)報(bào)道在眾多的腫瘤組織中均呈低表達(dá)情況[10-12]。有研究證明TIP30在肝細(xì)胞癌中的抑瘤作用可能是通過抑制ETS1蛋白及AP1等協(xié)同OPN啟動子區(qū)域的nt266下調(diào)OPN表達(dá)從而抑制肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移[13-14]。但這一機(jī)制并未在其他腫瘤組織中得以證實(shí)。

吉非替尼是EGFR的靶向小分子酪氨酸激酶抑制劑，其主要作用是抑制EGFR胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶的活性。文獻(xiàn)報(bào)道TIP30進(jìn)行基因敲除后可加快EGFR細(xì)胞核內(nèi)化，以及可使肺上皮干細(xì)胞及祖細(xì)胞數(shù)目增加，導(dǎo)致EGFR表達(dá)上調(diào)，激活EGFR下游信號通路，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[15]。而我們研究發(fā)現(xiàn)TIP30基因抑制的小鼠對吉非替尼的敏感性更強(qiáng)，這提示TIP30可作為吉非替尼療效的預(yù)測指標(biāo)。

綜上所述，TIP30的抑制可增強(qiáng)EGFR抑制劑吉非替尼的抑瘤敏感性，但是否還受諸如遺傳等其他因素的影響仍需進(jìn)一步研究。

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Correlation of TIP30 gene expression and the antitumor effect of gefitinib in the treatment of lung cancer in vivo.

CHEN Jin-zhang1,HUANGWei2,ZHENGDa-yong1,RUAN Jian1,CHEN Feng-sheng1,LIAi-min1.1.Department of Oncology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,CHINA;2.Department of Oncology,the FirstPeople's Hospital of Shunde,Shunde,528300,Guangdong,CHINA.

Objectivee To investigate the correlation of TIP30 gene expression and the antitumor effectof gefitinib in the treatmentof lung cancer in vivo.Methods Twelvemicewere random ly divided into experimental group and control group.Tumormodelwereestablished in two groups by subcutaneous injection of lung cancer cells.TIP30 low-expressionmodelwas established by silencing TIP30 genes in the experimentgroup;however,therewas no any treatment in the control group.Then we used the real-time quantitative PCR and western blotmethod to detect the TIP30 gene expression.Gefitinib were used in both groups in a concentrate of 10mg/d.As a result,both the anatom y and pathological effect of tumor inhibition were found after 15 days.ResultsThe lung cancermodels inmicewas successfulestablished.Real-time quantitative PCR and w estern blot confirmed thatexpression of TIP30 in experimental group was significantly lower than that in control group(P＜0.01).After the first five days there was no statistical difference between groups in theaverageweightof tumor on theuse of gefitinib,while therewere significant statistical differences between groups at the first7 days and 15 days(P＜0.05).PathologicalResultsalso showed that the tumor inhibitory effect in experimental group was significantly stronger than that in controlgroup.ConclusionTIP30 gene can havea facilitating role in theantitumoreffect in vivo.

TIP30;Lung cancer;Epithelialgrow th factor receptor(EGFR);In vivo

R-332

D

1003—6350（2014）04—0472—03

2013-08-26)

廣東省自然科學(xué)基金（編號：S2012010009392）；南方醫(yī)院院長基金（編號：2011C001）

李愛民。E-mail：Liaimin2005@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0184