HepaSphere微球聯(lián)合Avasting栓塞治療VX2兔肝癌的實(shí)驗(yàn)研究

杜玉清，張磊，孫學(xué)棟，顧文權(quán)，王彬

(上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院腫瘤介入科，上海 200125)

·論著·

HepaSphere微球聯(lián)合Avasting栓塞治療VX2兔肝癌的實(shí)驗(yàn)研究

杜玉清，張磊，孫學(xué)棟，顧文權(quán)，王彬

(上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院腫瘤介入科，上海 200125)

目的探討HepaSphere微球聯(lián)合Avasting肝動(dòng)脈栓塞治療兔移植性肝癌的療效。方法建立40只兔VX2肝癌模型，隨機(jī)分為四組，每組10只，A組：肝動(dòng)脈灌注生理鹽水；B組：肝動(dòng)脈灌注Avasting；C組：肝動(dòng)脈HepaSphere栓塞；D組：肝動(dòng)脈HepaSphere+Avasting栓塞。兩周后復(fù)查CT確定種植成功并計(jì)算瘤體大小，免疫組化方法檢測肝腫瘤血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)和腫瘤微血管密度(MVD)。所得數(shù)據(jù)使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組間比較采用q檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。結(jié)果腫瘤生長抑制D組明顯優(yōu)于其他組(P＜0.05)；VEGF的表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)D組顯著低于其他組(P＜0.05)。結(jié)論HepaSphere微球聯(lián)合Aasting行兔肝動(dòng)脈栓塞能抑制移植型肝癌的生長及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，并對腫瘤組織的微血管和VEGF的表達(dá)具有顯著的抑制作用。

微球；Avasting；栓塞治療

經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)目前已成為公認(rèn)的治療不可切除性中晚期肝癌的首選療法，針對肝癌的富血管性及主要通過肝動(dòng)脈獲取血供的特點(diǎn)，采用藥物與碘油乳化制成栓塞劑，阻塞腫瘤血供從而誘導(dǎo)腫瘤死亡，取得了明顯的治療效果，但其遠(yuǎn)期療效仍不能令人滿意，肝癌TACE術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是療效欠佳的主要原因。肝癌TACE術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的原因之一是栓塞劑不理想，不能達(dá)到真正的末梢及相對永久的栓塞；腫瘤血管形成為另一個(gè)主要原因[1-2]。如何做到腫瘤血管完全栓塞及抑制腫瘤新生血管是腫瘤研究的重點(diǎn)和發(fā)展方向[3]。本研究采用Aasting聯(lián)合HepaSphere微球行兔移植性肝癌肝動(dòng)脈栓塞治療，探討HepaSphere微球的栓塞療效及局部藥物抑制腫瘤血管再生的作用，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選用新西蘭大白兔40只，雌雄不限，兔齡約3個(gè)月，體重2 kg，由復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。VX2腫瘤瘤株：由普陀區(qū)中心人民醫(yī)院惠贈(zèng)。Hepa-Sphere微球：丙烯酸鈉與乙烯醇的共聚物，由日本大阪KGT?？漆t(yī)院Hori教授惠贈(zèng)。檢查設(shè)備：GE平板DSA(Innova3100)，東芝Aquilion one 320排螺旋CT掃描機(jī)、Philip Briliance16排螺旋CT掃描機(jī)。

1.2 VX2肝癌模型制作和實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VX2肝癌模型的建立兔術(shù)前禁食水12 h，以速眠新II(0.2m l/kg)肌注麻醉，完整取出荷瘤種兔腿外側(cè)瘤塊，泡于盛有生理鹽水的玻璃皿中，用眼科剪剪成約1mm3瘤塊備用；將健康實(shí)驗(yàn)兔麻醉后，仰臥固定，兔腹脫毛消毒。選取肝左葉實(shí)質(zhì)較厚處為接種部位，CT導(dǎo)向下將18G血管穿刺針刺入兔肝內(nèi)，調(diào)整針尖部位，用13G骨穿針之平頭探子將穿刺針內(nèi)容物推送入肝，反復(fù)推送2～3次。推送完畢退出穿刺針及平頭探子，局部壓迫1～2m in。

1.2.2 TAE治療VX2肝癌模型制作術(shù)后第14天，CT檢查確定瘤株種植成功后將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分成四組(A、B、C、D組)，每組10只。實(shí)驗(yàn)兔麻醉固定后，腹股溝區(qū)備皮、消毒、鋪巾，靠近腹股溝區(qū)沿股動(dòng)脈縱行切開皮膚，暴露股動(dòng)脈鞘，小心剪開股動(dòng)脈鞘，分離出1～2 cm長的股動(dòng)脈，近遠(yuǎn)端分別用4#絲線穿過備用。提起近端絲線，保持適當(dāng)張力以暫時(shí)阻斷血流，用眼科剪在股動(dòng)脈前壁剪一小“V”形口，將短導(dǎo)絲插入，成功后將自制導(dǎo)管鞘順導(dǎo)絲插入股動(dòng)脈并向近端送入約4 cm，結(jié)扎近端備用絲線以固定導(dǎo)管鞘。經(jīng)鞘管引入3F微導(dǎo)管，尋找到腹腔動(dòng)脈后行造影，確認(rèn)肝固有動(dòng)脈，超選擇性插管至肝左或肝右動(dòng)脈進(jìn)行造影，證實(shí)腫瘤染色后按照分組要求注入藥物。A組：生理鹽水；B組：5mg Avasting；C組：HepaSphere微球；D組：HepaSphere微球+5mg Avasting。術(shù)畢將導(dǎo)管撤至腹主動(dòng)脈時(shí)推注青霉素80萬U，拔除導(dǎo)管及鞘管，并同時(shí)結(jié)扎股動(dòng)脈近遠(yuǎn)端，逐層縫合切口。

1.2.3 影像學(xué)評價(jià)CT平掃+增強(qiáng)掃描：VX2肝癌模型制作術(shù)后14 d、TACE術(shù)后14 d分別行CT平掃加增強(qiáng)，參數(shù)設(shè)置：100 kV、120mAs、層厚5mm、間距5mm、對比劑總量4～5m l、流速為1 m l/s。確定肝內(nèi)腫瘤生長，測量腫瘤體積變化[V=ab2/2](a為腫瘤最大徑，b為腫瘤最小徑)，觀察腫瘤數(shù)量及腫瘤壞死情況。腫瘤壞死程度，按以下標(biāo)準(zhǔn)分為3度：腫瘤壞死＜50%為輕度壞死，壞死50%～90%為中度壞死，壞死＞90%為重度壞死。

1.2.4 病理及免疫組化檢查各組于治療后14 d CT掃描后處死所有VX2肝癌兔；摘取肝臟，先進(jìn)行大體觀察，然后切取癌灶及其周圍肝組織，用4%甲醛將解剖標(biāo)本浸泡、固定，常規(guī)石蠟包埋。盡量取與灌注掃描層面相同的切面切片，然后由病理科專職技術(shù)員作HE染色及MVD、VEGF免疫組化染色。由專職從事免疫組化檢查的病理學(xué)專家觀察MVD及VEGF表達(dá)情況，免疫組化檢查試劑由武漢博士德生物工程有限公司提供。MVD及VEGF表達(dá)測定在400倍光學(xué)顯微鏡下取3個(gè)“感興趣區(qū)”(陽性細(xì)胞分布最密集的區(qū)域)，取其平均數(shù)為該病例的VEGF陽性染色細(xì)胞數(shù)。MVD記數(shù)參照Weidnert的評判標(biāo)準(zhǔn)，選擇3個(gè)高倍視野血管密度“感興趣區(qū)”區(qū)域，任何黃染的細(xì)胞或細(xì)胞簇即使未顯示管狀結(jié)構(gòu)，只要和鄰近的微血管、腫瘤細(xì)胞或其他結(jié)締組織分開均計(jì)為1個(gè)血管，計(jì)算3個(gè)“感興趣區(qū)”計(jì)數(shù)均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較采用q檢驗(yàn)，術(shù)前及術(shù)后比較采用χ2檢驗(yàn)，VEGF的表達(dá)比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，肝腫瘤MVD計(jì)數(shù)的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAE治療8只實(shí)驗(yàn)兔因TACE或肝動(dòng)脈造影后7 d之內(nèi)死亡而被剔除，其中A組1只，B組2只，C組3只，D組2只。死亡可能與手術(shù)創(chuàng)傷和異位栓塞有關(guān)。各組完成所有指標(biāo)觀察的實(shí)驗(yàn)兔只數(shù)：A=9，B=8，C=7，D=8。TAE術(shù)后14 d復(fù)查造影：A組和B組治療前后腫瘤供血無明顯變化；C、D組原栓塞的腫瘤供血?jiǎng)用}未見再通，C組腫瘤邊緣見明顯腫瘤新生血管，D組腫瘤邊緣未見或少見腫瘤新生血管。

2.2 腫瘤體積改變D組治療后腫瘤體積增大明顯小于A、B、C組，腫瘤體積變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A、D組：q=62.24，P＜0.01；B、D組：q=57.79，P＜0.01；C、D組：q=28.38，P＜0.01)，見表1。

表1 治療前后腫瘤體積變化(±s)

表1 治療前后腫瘤體積變化(±s)

組別組數(shù)(只)治療14 d腫瘤體積增大變化(cm3) A組B組C組D組9878 3.19±0.2 3.05±0.18 0.57±0.02 0.04±0.01

2.3 治療前后腫瘤CT強(qiáng)化特點(diǎn)各組均可見腫瘤中心區(qū)低密度無強(qiáng)化壞死區(qū)，C、D組壞死程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.348 2，P=0.067)；D組壞死程度重于A、B組(χ2=4.287 5，P=0.038 4；χ2=12.444，P=0.000 4)；腫瘤及邊緣強(qiáng)化：A、B組腫瘤邊緣以中度強(qiáng)化為主，C組腫瘤邊緣輕度強(qiáng)化，D組輕度或未見強(qiáng)化，D組腫瘤強(qiáng)化弱于A、B、C組(A、D組：χ2=17.000，P=0.000；B、D組：χ2=16.000，P=0.000 1；C、D組：χ2=4.285 7，P=0.038 4)，見表2。

表2 治療前后腫瘤壞死及CT強(qiáng)化程度（只）

2.4 組織學(xué)與免疫組化

2.4.1 組織學(xué)檢查VX2腫瘤細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈巢狀分布，多為圓形、梭形，胞質(zhì)較少，核大而深染，間質(zhì)較少，瘤細(xì)胞異型明顯，病理性核分裂象多見；治療后D組觀察腫瘤組織內(nèi)為結(jié)構(gòu)混亂的異型細(xì)胞團(tuán)，巢狀分布的瘤細(xì)胞團(tuán)內(nèi)可見大片狀或多個(gè)小片狀壞死區(qū)，大部分瘤細(xì)胞核固縮及核碎裂；C組可見壞死灶周圍有較多炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)內(nèi)有充血、擴(kuò)張的毛細(xì)血管。

2.4.2 免疫組化檢查D組中腫瘤微血管稀少，VEGF陽性細(xì)胞散在或未見分布；C組腫瘤組織及鄰近間質(zhì)內(nèi)微血管多而密集，VEGF陽性細(xì)胞彌漫分布于癌巢中；B組與A組腫瘤微血管密度及VEGF陽性細(xì)胞數(shù)居中；D組VEGF表達(dá)均較其他組明顯減低(A、D組：H=12.210 6，P＜0.05；B、D組：H=12.564 6，P＜0.05；C、D組：H=13.005 6，P＜0.05)；MVD計(jì)數(shù)各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 各組兔肝腫瘤組織中VEGF表達(dá)和MVD計(jì)數(shù)情況(只)

3 討論

3.1 本研究所使用栓塞劑的特點(diǎn)HepaSphere微球是一種高吸水性聚合物-丙烯酸鈉與乙稀醇的共聚物(Acrylic acid sodium salt-polyvinyl alcohol copolyer)，呈完全性球體形狀、無色透明硬質(zhì)顆粒，具有幾個(gè)特點(diǎn)：①在血管內(nèi)膨脹；②顆粒呈球體；③富有顯影性，可作為永久性栓塞材料[4-5]。HepaSphere微球能吸收造影劑并隨造影劑在動(dòng)脈內(nèi)流動(dòng)，栓塞過程中可監(jiān)視栓塞材料的流動(dòng)狀態(tài)而防止其返流。Hepa-Sphere微球吸收離子性造影劑后顆粒直徑由2倍增至2.5倍。把這些顆粒再移入血清1m in后增大至3.5倍。吸收了離子性造影劑的顆粒則變得柔軟而富有變形性，平均直徑在0.7mm的顆粒能暢通無阻地通過內(nèi)徑0.53mm的微導(dǎo)管[6]。

3.2 HepaSphere微球行肝動(dòng)脈栓塞治療兔移植性肝癌的療效觀察本研究中C與D組均使用Hepa-Sphere微球，不同點(diǎn)為D組吸附Avasting。DSA透視下可見該栓塞劑注入肝動(dòng)脈后順血流快速到腫瘤達(dá)末梢小動(dòng)脈內(nèi)，微球吸收血清后，進(jìn)一步增大，不留縫隙地充填血管內(nèi)腔，完全使末梢小動(dòng)脈及其分支完全性閉塞，栓塞劑在瘤內(nèi)沉積。復(fù)查造影見腫瘤血管及分支完全性閉塞，腫瘤染色消失。栓塞后2周復(fù)查DSA：兩組均未見栓塞后腫瘤血管再通，但C組見再腫瘤周圍有細(xì)小腫瘤新生血管。CT及病理顯示：D組腫瘤增長最慢，瘤內(nèi)壞死最明顯；C組腫瘤生長略快于D組，壞死范圍稍小，但兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組腫瘤生長最快，腫瘤中心壞死最少，B組腫瘤生長速度與腫瘤壞死與A組相似。但A、B組與D組比較無論腫瘤生長還是腫瘤壞死率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此我們認(rèn)為HepaSphere微球能選擇性到達(dá)腫瘤供血?jiǎng)用}并將在腫瘤供血細(xì)小動(dòng)脈及分支內(nèi)快速增大，達(dá)到徹底腫瘤阻斷腫瘤供血的作用，具有明顯的抑制腫瘤生長的作用，其療效較為可靠。

3.3 抗腫瘤新生血管作用HepaSphere微球吸附藥物可作為一種藥物載體，在局部充分發(fā)揮藥物療效。Avastin是一種重組人源化抗VEGF的單克隆抗體，通過與循環(huán)中VEGF的競爭性結(jié)合，阻止VEGF與相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而阻止腫瘤新生血管的發(fā)生，且Avasting可使腫瘤及其周圍組織的血管分布正?；?，因此可通過降低腫瘤組織間質(zhì)壓而有利于化療藥物的傳遞。Avasting單藥治療晚期肝細(xì)胞癌的療效已初獲證實(shí)，目前應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療，其抗腫瘤新生血管作用具有濃度與時(shí)間依賴性等特征[7]，因此臨床上主要采用持續(xù)靜脈滴注配合全身靜脈化療，也有與碘油混合行肝動(dòng)脈化療栓塞治療肝癌的報(bào)道[8]。

本研究結(jié)果顯示，HepaSphere微球聯(lián)合Avasting栓塞治療VX2肝癌，有明顯移植腫瘤新生血管的作用。在治療2周后復(fù)查DSA、CT及組織病理，D組無論是影像學(xué)表現(xiàn)還是VEGF表達(dá)水平和MVD值均低于A、B、C組(P＜0.05)。

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Effect of transarterial embolization with Avasting combined with HepaSphere in the treatment of rabbit with VX2 hepati ccarcinoma.

DU Yu-qing,ZHANG Lei,SUN Xue-dong,GU Wen-quan,WANG Bin.Department of Interventional Oncology,ShanghaiPunan Gynecology Hospital,Shanghai 200125,CHINA

ObjectiveTo study the therapeutic effect of transarterial embolization w ith Avasting and hepa-Sphere for rabbitswith VX2 liver carcinoma.MethodsForty rabbits implanted with liver VX2 tumorswere randomly divided into four groups,w ith 10 rabbits in each group.All rabbitswere demonstrated with liver neoplasmas by MSCT and treated w ith transhepatic arterial embolization under the open laparotomy.Group A was given 3m l saline; Group B was infused with 5mg Avasting injection;Group C was embolized w ith hepaSphere;Group D was administrated w ith 5mg Avasting and hepaSphere.Mutislice spiral CT scan w as performed to measure tumor volume and the expression of MVD and VEGF were determinedwith immunohistochem istry on the 14thday after treatment.A llparameter thus gained were com pared among the four groups.ResultsGroup D show ed the grow th of tumor significantly better other three groups(P＜0.05).The expression of MVD and VEGF in group D was significantly lower than that in othergroups(P＜0.05).ConclusionTransarterial embolizationw ith Avasting combined hepaSphere can effectively inhibitthegrow th ofhepatic tumorand reduce theexpression levelof VEGFand the formation of the tumorvessels.

Microspheres;Avasting;Transarterialembolization

R-332

A

1003—6350（2014）04—0469—03

2013-11-23)

上海市衛(wèi)生局資助課題（編號(hào)：20114176）；上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)學(xué)科群項(xiàng)目(編號(hào)：PWZxkq2011-02)

杜玉清。E-mail：du_yqsh@sina.cn

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0183