覆盆子總黃酮超聲波提取工藝響應(yīng)面法優(yōu)化及其抗氧化特性研究

鄔玉芬，吳 俊，喻衛(wèi)武*

（1.寧?？h林特技術(shù)推廣總站，浙江 寧海 315600；2.浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 杭州 311300）

覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物的果實(shí)，其干燥成熟果實(shí)為常用中藥，性甘、酸、溫，歸肝、腎、膀胱經(jīng)，益腎固精縮尿，養(yǎng)肝明目，用于遺精滑精，遺尿尿頻，陽痿早泄，目暗昏花[1]。成熟果實(shí)是新型高營養(yǎng)的野生或半野生果品，用于食療和保健，是高營養(yǎng)、高抗性、無污染的綠色新型第3代水果。主產(chǎn)自浙江、江蘇、安徽、江西、福建、廣西等省。生長在陽光較充足、海拔400～800m的山坡灌叢和林緣現(xiàn)代研究表明[2]，覆盆子含有萜類、黃酮、甾醇、氨基酸等化學(xué)成分，具有抑菌、抗氧化、壯陽興痿、健腦益智、美容養(yǎng)顏、防治癌癥的作用，同時(shí)還有保護(hù)或提高視力、減肥等功效[3～6]。文獻(xiàn)中對黃酮類化合物成分的抗氧化作用研究報(bào)道較多[7～10]。

超聲提取具有提取時(shí)間短、溫度較低、收率高的優(yōu)點(diǎn)[11～13]。目前，關(guān)于超聲提取覆盆子黃酮化合物的工藝研究較少。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取覆盆子總黃酮的最佳提取工藝，并分析了總黃酮對羥自由基（OH·）及超氧陰離子自由基（O2－·）的清除率，以期得到較優(yōu)提取工藝和覆盆子總黃酮的抗氧化特性，為覆盆子進(jìn)一步開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

試驗(yàn)所用覆盆子于2011年5月20日采自臺(tái)州仙居縣橫溪鎮(zhèn)，經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)何?；淌阼b定為華東覆盆子（Rubus chingii）。

蘆?。ㄉ噭?，上海晶純試劑有限公司）；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過氧化氫、水楊酸、鹽酸、硫酸亞鐵、硫代硫酸鈉等化學(xué)試劑均為分析純（AR）。

FA2104N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-2100紫外分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；FW-型高速萬能粉碎機(jī)（北京中信偉業(yè)科技公司）；KQ-250B超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品25.00mg于100m L量瓶中，加入少量80%乙醇，超聲溶解后定容到刻度，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確量取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0m L分別置于10m L的比色管中，加5%NaNO2溶液0.4m L，搖勻，放置6min；然后各加10%的Al(NO3)3溶液0.4m L搖勻，放置6min；然后各加4%的NaOH溶液4 m L搖勻，最后用水稀釋到刻度，混勻，放置15 m in，以80%乙醇同法處理為參比，在最大吸收波長510 nm處測定吸收光度值A(chǔ)。以A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.948 57C－0.003 1，R2=0.999 6，在考查范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 覆盆子總黃酮提取和測定

稱取覆盆子粉末約5 g置于燒杯中，再加入乙醇，將燒杯置于已經(jīng)設(shè)定好超聲時(shí)間和溫度的超聲儀中進(jìn)行超聲提取。超聲完畢將提取溶液過濾，80%乙醇定容至100m L，移取2m L置于10m L容量瓶中，80%乙醇定容備用。按照2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下操作，測供試液的吸光值，結(jié)果以3次測定的平均值計(jì)。

2.3 響應(yīng)面法中心試驗(yàn)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用響應(yīng)面法來優(yōu)化影響用超聲輔助提取覆盆子總黃酮提取率的參數(shù)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12]，選取超聲時(shí)間、料液比及超聲溫度三個(gè)因素，采用三因素三水平分析法，分析因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

2.4 覆盆子總黃酮的抗氧化性測定

2.4.1 覆盆子總黃酮對羥自由基清除率的測定 采用紫外分光光度法[14]測定總黃酮對羥自由基（OH·）的清除率。取5支具塞試管依次向其中各加入2.0mmol/L的FeSO42.0m L、1.0mmol/L的H2O22.0m L振蕩，搖勻。再加入6.0mmol/L的水楊酸3.0m L，搖勻，于37℃水浴加熱20m in，加熱完畢于510 nm 波長處分別測定吸光度A0。之后分別向5支試管中加入待試樣品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L，接著再分別添加超純水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0m L，搖勻，繼續(xù)水浴加熱20min，待加熱完畢后再次分別測其吸光度Ax。對照實(shí)驗(yàn)：用2.0m L蒸餾水取代H2O2溶液，重復(fù)上述過程，測吸光度，則樣品對羥自由基的清除率計(jì)算見以下公式：

2.4.2 覆盆子總黃酮對超氧陰離子自由基（O2－·）清除率的測定 采用紫外分光光度法對總黃酮O2－·的清除率進(jìn)行測定。取6支試管，分別編號(hào)為0、1、2、3、4、5，各加入4.5m L pH8.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖液，再分別加入黃酮提取液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0m L，然后依次加蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0m L，混勻后在25℃恒溫水浴中保溫20min，取出后立即加入在25℃預(yù)熱過的3mmol/L鄰苯三酚溶液0.3m L（以10 mmol/L HCl溶液配制）。5m in后加4滴10mol/L鹽酸終止反應(yīng)。以管0為空白，測其他樣品在325 nm處的吸光度。按照以下公式計(jì)算各質(zhì)量濃度總黃酮提取液對O2－·的清除率。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

3.1 響應(yīng)面法優(yōu)化覆盆子總黃酮提取工藝

對覆盆子總黃酮超聲提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)方案見表2。15個(gè)試驗(yàn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，試驗(yàn)號(hào)1～12是析因試驗(yàn)，13～15是中心試驗(yàn)。其中析因點(diǎn)為自變量取值在X1，X2，X3所構(gòu)成的三維定點(diǎn)，零點(diǎn)區(qū)域?yàn)橹行狞c(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

采用Design Expert7.0.0軟件對中心組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。以覆盆子總黃酮得率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，得到回歸方程：

回歸方程中各變量對指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，由F檢驗(yàn)來判定，概率P（F＞Fα）的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。

由表3可知，上述回歸方程在描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.961 8）。說明該回歸方程對試驗(yàn)擬合情況好，可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。在一次項(xiàng)和二次項(xiàng)中都有顯著性因素，因此各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。響應(yīng)值Y與X3，，2呈極顯著相關(guān)，與X呈顯著相關(guān)。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y對各試驗(yàn)因子X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間曲面圖，從響應(yīng)面圖上可清晰地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用關(guān)系。當(dāng)特征值為正值時(shí)的響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面，可以得到極小值；當(dāng)特征值為負(fù)值時(shí)則為山丘曲面，有極大值存在；當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)為馬鞍形曲面，無極值存在。由圖2、圖3、圖4可較為直觀地看出各因素對覆盆子總黃酮得率的影響，曲線越陡峭，表明該因素對覆盆子總黃酮得率的影響越大，響應(yīng)值的變化亦愈大。由等值線圖可以看出存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。

表3 總黃酮提取參數(shù)數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果

圖2 提取時(shí)間與液料比對得率影響的響應(yīng)面與等值線

圖3 提取時(shí)間與提取溫度對得率影響的響應(yīng)面與等值線

圖4 液料比與提取溫度對得率影響的響應(yīng)面與等值線

對回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，解得X1=0.04，X2=0.35，X3=0.23，代入變換公式即得提取時(shí)間91.2min，液料比33.5：1，提取溫度42.3℃，此條件下覆盆子總黃酮的得率預(yù)測值為4.81%。采用優(yōu)化條件進(jìn)行提取試驗(yàn)，實(shí)際得率為4.52%，與理論預(yù)測值基本吻合。

3.2 覆盆子總黃酮抗氧化性的測定

3.2.1 覆盆子總黃酮對羥自由基的清除作用 羥基自由基是一種較活潑的氧自由基粒子，具有反應(yīng)活性強(qiáng)、毒性大等特點(diǎn)。它可以與生物體內(nèi)的多種物質(zhì)發(fā)生高效、快速的反應(yīng)，導(dǎo)致生物機(jī)體的損傷和各種病變發(fā)生。研究表明黃酮類化合物主要通過清除自由基作用，有效阻止脂質(zhì)過氧化引起的細(xì)胞破壞。由表4可以看出，覆盆子總黃酮對羥自由基有較好的清除率，在12.75～51.00mg/L的范圍內(nèi)隨著總黃酮濃度的增大清除作用明顯增強(qiáng)，在黃酮濃度大于51.00mg/L后清除率趨于恒定。

表4 覆盆子總黃酮對羥自由基的清除率

3.2.2 覆盆子總黃酮對超氧陰離子自由基的清除作用 O2－·是氧氣在生物體內(nèi)的電子傳遞和一些生物分子的還原作用下得到一個(gè)電子而生成的，有著很強(qiáng)的活性，可直接導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷，還能轉(zhuǎn)化為氧化性更強(qiáng)的羥基自由基，從而引發(fā)含有大量不飽和脂肪酸的細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，形成鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，破壞膜結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞損傷。由表5可以看出，覆盆子總黃酮對超氧陰離子自由基有一定的清除率，在8.51～34.24mg/L的范圍內(nèi)隨著總黃酮質(zhì)量濃度的增大清除作用顯著增大，在黃酮濃度大于34.24mg/L后清除率增加趨勢減緩。

表5 覆盆子總黃酮對超氧陰離子自由基的清除率

4 討論

本試驗(yàn)響應(yīng)面分析法考察了超聲提取時(shí)間、液料比、提取溫度對覆盆子總黃酮提取率的影響，建立了影響黃酮提取率的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，依據(jù)回歸分析結(jié)果可知，覆盆子總黃酮超聲提取最佳條件為提取時(shí)間 91.2m in，液料比33.5：1，提取溫度42.3℃，總黃酮的得率預(yù)測值為4.81%。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際得率為4.52%，與理論預(yù)測值基本吻合。對覆盆子總黃酮抗氧化研究表明：覆盆子總黃酮對羥自由基和超氧陰離子自由基都有一定的清除率，并在一定范圍內(nèi)隨著黃酮質(zhì)量濃度的增大而增大。隨著植物提取物抗氧化活性研究不斷的深入，越來越多的有抗氧化活性物質(zhì)被應(yīng)用到化妝品、保健品和藥品領(lǐng)域，表現(xiàn)出了廣闊的開發(fā)前景。通過本實(shí)驗(yàn)證明覆盆子總黃酮具有較強(qiáng)的羥自由基和超氧陰離子自由基清除率。因此，本實(shí)驗(yàn)可以為覆盆子總黃酮的提取和在化妝品、保健品和藥品等領(lǐng)域進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

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