鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白的表達(dá)、純化和結(jié)晶

萬群，祝娉婷，呂后寧，陳欣虹

揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化系，江蘇 揚(yáng)州 225001

驅(qū)動(dòng)蛋白 (Kinesin) 是一種在所有真核生物中都廣泛存在的運(yùn)動(dòng)蛋白 (Motor protein)[1-2]。驅(qū)動(dòng)蛋白的主要功能包括：細(xì)胞器(Organelle) 和囊泡 (Vesicle) 的運(yùn)輸[3-4]；染色體/紡錘體的轉(zhuǎn)移[5-6]。因此，它在細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞有絲分裂與減數(shù)分裂等方面起著重要作用。驅(qū)動(dòng)蛋白由幾個(gè)單體在“頸”和“軀干”部位纏繞形成多聚體，從而形成“頭、頸、軀干和尾部”等區(qū)域[7]。驅(qū)動(dòng)蛋白的頭結(jié)合在微管(Microtubule) 系統(tǒng)上，尾部結(jié)合在將要轉(zhuǎn)移的細(xì)胞器或紡錘體上，頸和軀干則將頭尾分開。驅(qū)動(dòng)蛋白利用ATP水解成ADP和磷酸過程中釋放的能量沿著微管系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)來完成上述功能。大部分種類的驅(qū)動(dòng)蛋白具有運(yùn)動(dòng)的連續(xù)性：蛋白可以在微管上以“雙手交互”的方式連續(xù)運(yùn)動(dòng)幾百步都不從微管上掉下來[8-9]。這些驅(qū)動(dòng)蛋白被稱為常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白 (Conventional kinesin)。理解驅(qū)動(dòng)蛋白如何將ATP中儲(chǔ)藏的化學(xué)能轉(zhuǎn)化成機(jī)械的動(dòng)能是了解這種蛋白運(yùn)動(dòng)特性的重要課題。獲得驅(qū)動(dòng)蛋白在ATP水解的不同階段的晶體結(jié)構(gòu)可以在原子水平了解ATP水解機(jī)理和相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)變化。Kif1A和Eg5是不像常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白那樣具有高運(yùn)動(dòng)連續(xù)性的驅(qū)動(dòng)蛋白[10-11]。它們具有ATP酶活力的N-端區(qū)域同ATP的結(jié)構(gòu)類似物AMPPNP和AMPPCP[12]的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)揭示了ATP的γ-磷酸基團(tuán)是如何同連接微管結(jié)合區(qū)域的開關(guān)區(qū)域 (Switch region) 互動(dòng)的[13-15]。但是，kif1A和Eg5都不具有常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白那樣的“雙手交互”的運(yùn)動(dòng)方式，而且運(yùn)動(dòng)的連續(xù)性也不高。因此，采用常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白來研究?jī)?chǔ)藏在ATP中的能量是如何轉(zhuǎn)化為動(dòng)能這一重要課題仍然是很有必要的。本研究采用鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白 (Rat brain kinesin) 這一具有代表性的常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白[7-16]，將其中具有水解 ATP功能和微管結(jié)合區(qū)域的 N-端區(qū)域在大腸桿菌中高效表達(dá)，經(jīng)離子交換樹脂和分子篩兩步純化，得到高純度的單體。從而為下一步的結(jié)晶和化學(xué)能轉(zhuǎn)化為動(dòng)能的機(jī)理研究打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

編碼鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白的N-端354個(gè)氨基酸的基因被克隆到表達(dá)載體pET-21(b) 上。這個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建(rK354)來自美國(guó)佛蒙特大學(xué)的 Dr.Kathleen Trybus實(shí)驗(yàn)室。它具有抗青霉素和氯霉素的抗藥性標(biāo)記。由于這個(gè)區(qū)域只包含很短的“頸部”序列，它在溶液中以單體狀態(tài)存在[16]。大腸桿菌BL21-Codon Plus (DE3) -RP感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

DNaseⅠ內(nèi)切酶、Bradford試劑、BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白、4- (2-氨乙基) 苯磺酰氟鹽酸鹽 (AEBSF)、甲苯磺酰賴氨酸氯甲酮 (TLCK)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硫蘇糖醇 (DTT)、ATP、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液 (HEPES buffer)、對(duì)二氮己環(huán)-1,4-二(2-乙磺酸) 緩沖液 (PIPES buffer)、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸 (EGTA) 購(gòu)自美國(guó) Sigma公司。兔源驅(qū)動(dòng)蛋白抗體 AKIN01購(gòu)自美國(guó)Cytoskeloton公司。蛋白胨 (Trypton) 和酵母提取物 (Yeast Extract) 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。蛋白濃縮管 Centricon Plus-20和 Centrion Ultra-15購(gòu)自美國(guó)Amicon公司。強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱由 80 mL SP-Sepharose (美國(guó) Amersham Biosciences公司產(chǎn)品) 樹脂填充在30 cm′3 cm玻璃柱中。分子篩柱由 70 mL Sephacryl S-200HR (美國(guó)Amersham Biosciences公司產(chǎn)品)樹脂填充在90 cm′1 cm玻璃柱中。結(jié)晶試劑盒Crystal ScreenTM、IndexTM、PEG×IonTM、PEGRx購(gòu)自美國(guó)Hampton Research公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的化學(xué)轉(zhuǎn)化

將約0.2 mg rK354質(zhì)粒加入到100 mL剛解融的BL21-Codon Plus (DE3)-RP感受態(tài)細(xì)胞中，在冰上靜置20 min后，在42 ℃水浴中熱休克40 s，然后在冰上靜置5 min，最后再加入900 mL無菌LB培養(yǎng)液 (1% (W/V) 蛋白胨、0.5% (W/V)酵母提取物、1% (W/V) 氯化鈉)。上述細(xì)胞混合物在37 ℃搖床中培養(yǎng)1 h后，5 000′g離心，去除950 mL上清液。剩下的50 mL培養(yǎng)液混勻后，涂在含氯霉素的LB瓊脂糖平板 (LB培養(yǎng)液加上1.5% (W/V) 瓊脂糖)上，37 ℃過夜得到菌落。

1.2.2 蛋白表達(dá)

將瓊脂糖平板上長(zhǎng)出的單菌落接種到5 mL含50 mg/mL青霉素和100 mg/mL氯霉素的無菌LB培養(yǎng)液中，并在37 ℃培養(yǎng)過夜。每10 mL上述細(xì)菌過飽和培養(yǎng)液再被接種到 1 L含抗生素的無菌TB培養(yǎng)液 (Terrific Broth：1.2% (W/V)蛋白胨、2.4% (W/V) 酵母提取物、0.4% (V/V) 甘油、0.017 mol/L KH2PO4、0.072 mol/L K2HPO4)中37 ℃培養(yǎng)3–4 h直到OD600值為0.6。上述4 L培養(yǎng)液降溫到22 ℃后，加入0.5 mmol/L IPTG，過夜 (約16 h) 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。大腸桿菌細(xì)胞在6 000′g離心后，稱重，在–80 ℃冰箱保存。

1.2.3 蛋白純化

冰凍的細(xì)胞在室溫下解凍后，以5 g/mL的濃度溶解于裂解緩沖液中 (10 mmol/L HEPES,10 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT, 10 mmol/L EGTA，1 mmol/L PMSF, 0.5 mmol/L AEBSF,0.5 mmol/L TLCK, 5 mmol/L MgCl2, 40 mg/mL DNaseⅠ，pH 7.2)。細(xì)胞混合液在冰浴中被超聲細(xì)胞破碎儀處理 40 min，直到大部分細(xì)胞都被裂解。細(xì)胞裂解液39 000′g離心1 h后，上清液加到被緩沖液 1 (10 mmol/L HEPES,10 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT, 10 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2, 0.5 mmol/L ATP) 預(yù)平衡的SP-強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹脂中。用至少5倍柱體積 (400 mL) 的平衡液清洗樹脂，直到?jīng)]有多余的蛋白從樹脂中洗脫出來 (用 Bradford試劑檢測(cè))。用 NaCl緩沖溶液將結(jié)合在樹脂上的目的蛋白梯度洗脫出來 (10–300 mmol/L NaCl,10 mmol/L HEPES, 10 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT, 10 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L ATP)，并被分布收集器收集。得到的蛋白洗脫液進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)，收集純化后的目的蛋白，用 Centricon Plus-20濃縮至3 mL。分子篩柱用緩沖液2 (20 mmol/L PIPES, 1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L KCl,1 mmol/L DTT, pH 7.5) 預(yù)平衡后，將上述蛋白濃縮液加到分子篩柱上。蛋白在分子篩柱中以0.08 mL/min的速度緩慢洗脫分離，并被分布收集器收集。分離的蛋白用 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)后，最純的部分被集中到一起，用Centricon Ultra-15濃縮到30 mg/mL以上的濃度 (蛋白濃度用BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定)。濃縮的蛋白用超速離心 (372 000′g) 去除可能的懸浮物后，在–80 ℃保存。

1.2.4 Western blotting檢驗(yàn)

具體過程參見文獻(xiàn)[17]。

1.2.5 基礎(chǔ)ATPase酶活 (Basal ATPase) 的測(cè)定

無微管激活時(shí)的驅(qū)動(dòng)蛋白基礎(chǔ)ATPase酶活(Basal ATPase activity) 用鉬酸銨/硫酸亞鐵混合液來測(cè)定在反應(yīng)中釋放的磷酸離子來測(cè)定[18]。具體過程如下：在 25 ℃將 2 mmol/L ATP和5 mmol/L MgCl2加入到 400 mL 含 0.3 mg/mL 驅(qū)動(dòng)蛋白的反應(yīng)液中。每10 min，從中取出50 mL反應(yīng)液，混入50 mL滅活液 (140 mmol/L EDTA,20% SDS, pH 6.5)。200 mL 顯色液 (2% 鉬酸銨，0.5%硫酸亞鐵) 繼而加入到上述混合液中，在25 ℃放置20 min顯色。最后，已顯色的溶液測(cè)定OD700。用無機(jī)磷酸在鉬酸銨/硫酸亞鐵混合液中的OD700值作出光吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線后，ATP的水解速率 (r) 可以通過以下公式計(jì)算：

(其中，OD/min是顯色反應(yīng)速率；nmols/OD是無機(jī)磷酸在鉬酸銨/硫酸亞鐵試劑中的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；MW是蛋白的分子量；對(duì)于rK354，b值為 1.68)。

1.2.6 結(jié)晶條件的篩選

用 Crystal ScreenTM、IndexTM、PEG×IonTM等結(jié)晶試劑盒以懸滴法篩選rk354的結(jié)晶條件：1 mL濃度為18 mg/mL的蛋白溶液在載玻片上與1 mL池液混合，與1 mL池液平衡。

1.2.7 晶體的衍射數(shù)據(jù)搜集和處理

晶體衍射數(shù)據(jù)由 Rigaku RUH3R發(fā)生器和Mar345成像板構(gòu)成的 X-光衍射儀收集，并用HKL2000[19]軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 蛋白純度與產(chǎn)率

SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果顯示，驅(qū)動(dòng)蛋白的純度達(dá)到95%以上 (圖1)。每升TB培養(yǎng)液可以得到10 mg以上的蛋白。在22 ℃條件下，驅(qū)動(dòng)蛋白可溶性地表達(dá)。在37 ℃，驅(qū)動(dòng)蛋白大部分存在于包涵體 (數(shù)據(jù)未顯示)。因此，筆者采用22 ℃常溫表達(dá)。在用陽(yáng)離子交換色譜純化驅(qū)動(dòng)蛋白時(shí)，筆者嘗試過pH 6.7、pH 6.9和pH 7.2三種不同的pH條件，結(jié)果顯示，pH 7.2的條件可以更好地去除雜蛋白 (數(shù)據(jù)未顯示)。

圖1 鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白純化的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE gel of rK354 purification. 1：standard protein ladder; 2： standard rK354 from Dr.Trybus’ lab; 3： cell lysate without IPTG induction; 4：cell lysate with 0.5 mmol/L IPTG induction; 5： the supernatant loaded to the SP-cation exchange resin; 6：the flow through from the SP-cation exchange resin; 7：the elution from the SP-cation exchange resin; 8： the elution from the size-exclusion chromatography.

2.2 Western blotting 檢測(cè)

純化的鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白與兔源驅(qū)動(dòng)蛋白抗體有一定的交叉抗性反應(yīng) (圖 2)，證實(shí)了驅(qū)動(dòng)蛋白的特異性。但是由于兔源驅(qū)動(dòng)蛋白抗體的交叉抗性不強(qiáng)，顯色結(jié)果不太理想。

2.3 基礎(chǔ)ATPase酶的活性

純化的驅(qū)動(dòng)蛋白具有 ATPase的酶活 (圖3)。在無微管激活的情況下，它的水解 ATP速率是 0.015 s–1。

2.4 結(jié)晶條件的篩選

在用多個(gè)結(jié)晶試劑盒篩選結(jié)晶條件并加以改進(jìn)后，rK354可以在以下條件結(jié)晶 (圖4A)：1.7 mol/L硫酸銨, 500 mmol/L 氯化鈉, 20% 甘油 (V/V)。

2.5 晶體衍射數(shù)據(jù)的處理和分析

圖2 鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白的Western blotting檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Western blotting analysis of the purified rK354.1?3： purified rK354; 4： the cell lysate after IPTG induction; 5： the cell lysate without IPTG induction; 6：the rK379 standard protein (from Dr. Trybus’ lab); 7：the rK406 standard protein (from Dr. Trybus’ lab).

圖3 鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白rK354的ATPase酶活Fig. 3 ATPase activity of the purified rK354.

晶體的衍射分辨率為2.0 ? (圖4B)。在分析了晶體衍射數(shù)據(jù)的對(duì)稱性 (Symmetry) 和系統(tǒng)缺失 (Systematic absences) 后，得到的 rK354晶體的空間群是P212121，晶胞參數(shù)是：a=72.7 ?,b=74.2 ?, c=88.4 ?，分辨率為 2.0 ? (表 1)。

3 討論

常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白具有很高的運(yùn)動(dòng)連續(xù)性。研究常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白將ATP中儲(chǔ)藏的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為動(dòng)能是研究這一運(yùn)動(dòng)蛋白的重要課題。鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白作為一種具有代表性的常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白，在神經(jīng)介質(zhì)的傳遞方面起著重要的作用。筆者擬用蛋白晶體學(xué)的方法來研究鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白在ATP水解過程中結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，為此需要大量地純化蛋白。大腸桿菌作為蛋白表達(dá)的首選表達(dá)系統(tǒng)，具有操作簡(jiǎn)便、表達(dá)量高和價(jià)格低廉等多種優(yōu)點(diǎn)。但是，用大腸桿菌BL21(DE3)這一最常用的工程菌株來表達(dá)鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白，筆者沒有得到相關(guān)表達(dá)。嘗試使用BL21 StarTM(DE3) 作為RNaseE (一種重要的mRNA降解酶)缺陷型菌株可以得到0.5 mg/L培養(yǎng)液的產(chǎn)率，但是這個(gè)產(chǎn)率并不理想。BL21-Codon Plus (DE3)-RP感受態(tài)細(xì)胞可以大量轉(zhuǎn)錄在大腸桿菌中稀有的argU和proL兩個(gè)tRNA，而Arg和Pro在真核細(xì)胞表達(dá)的蛋白中普遍地存在[20]。本文結(jié)果顯示，采用Codon Plus感受態(tài)菌株可以將驅(qū)動(dòng)蛋白的產(chǎn)率提高 20倍以上 (大于 10 mg/L培養(yǎng)液)，從而為結(jié)晶學(xué)研究中蛋白質(zhì)的來源提供了可靠的保障。

表1 晶體衍射數(shù)據(jù)Table 1 Data collection statistics

以往的文獻(xiàn)采用pH 6.9條件下的陽(yáng)離子交換色譜 (磷酸纖維素樹脂)、陰離子交換色譜(Mono Q樹脂) 和分子篩色譜3個(gè)連續(xù)步驟來純化鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白[16]。因?yàn)榇蟛糠执竽c桿菌自身表達(dá)的蛋白的等電點(diǎn) (pI) 偏酸性[21]，所以在不影響目的蛋白同離子交換樹脂結(jié)合的情況下，適當(dāng)?shù)靥岣呱V純化時(shí)的 pH可以有效地去除雜蛋白，提高純化效率。筆者將離子交換純化時(shí)的pH提高到7.2，蛋白純度可以達(dá)到90%。這樣，加上后續(xù)的分子篩分離，兩步純化步驟就可以得到純度達(dá) 95%的驅(qū)動(dòng)蛋白，從而提高了純化效率和產(chǎn)率。

文獻(xiàn)中的鼠腦驅(qū)動(dòng)蛋白晶體只有ADP牢牢地結(jié)合在活性中心[16-22]，其他 ATP的結(jié)構(gòu)類似物由于親和力小，無法取代ADP而不能結(jié)合在活性中心。要研究ATP的水解機(jī)制，必須得到驅(qū)動(dòng)蛋白同ATP結(jié)構(gòu)類似物的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。因此，找到一個(gè)與ADP結(jié)合力不那么高的新的結(jié)晶條件就顯得非常重要。通過篩選，我們發(fā)現(xiàn)硫酸銨可以取代以往文獻(xiàn)里報(bào)道的硫酸鋰作為結(jié)晶沉淀劑。在加入濃度為500 mmol/L的NaCl作為添加劑后，晶體的X-光衍射分辨率可以從2.2 ?提高到2.0 ?。用液氮來快速冷凍蛋白晶體的過程中，為了防止冰晶的形成，我們添加了 20%的甘油為抗凍劑(Cryoprotectant)。晶體衍射結(jié)果顯示，20% 甘油作為添加劑不會(huì)影響到晶體的分辨率。在新的結(jié)晶條件得到的晶體的活性中心沒有 ADP，而只有一個(gè)硫酸根離子 (詳見后續(xù)研究結(jié)果)。這個(gè)新的結(jié)晶條件為ATP衍生物結(jié)合在活性中心提供了希望。

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