海洋紅細(xì)菌Lentibacter algarum胞外多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)解析

李佩佩，陳雪昌，張玉榮，張小軍, 梅光明，郭遠(yuǎn)明

浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021

多糖作為除核酸、蛋白以外的另一類大分子物質(zhì)，以其豐富的結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的理化性質(zhì)日益受到關(guān)注并得到廣泛的應(yīng)用。多糖按照來(lái)源分為植物多糖、動(dòng)物多糖和微生物多糖。不同來(lái)源的多糖在結(jié)構(gòu)上有很大的差異。微生物多糖相比其余兩種而言，組成更加復(fù)雜多樣，結(jié)構(gòu)更加豐富，并且微生物由于其發(fā)酵條件可控，不受地域、天氣季節(jié)、病蟲(chóng)害等因素的影響，可大規(guī)模發(fā)酵，應(yīng)用前景更加廣闊。凝乳糖、菌核葡聚糖、吉蘭多糖、黃原膠多糖等微生物多糖在食品和工業(yè)方面已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。

隨著對(duì)海洋微生物活性物質(zhì)研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)海洋微生物是獲得多糖的有效資源[3-5]。研究表明，絕大部分細(xì)菌都處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，常規(guī)條件下在培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)繁殖，所以能獲得和利用的微生物資源相比而言還非常有限。但是在一些理化因素及生物因素發(fā)生改變時(shí)，一些細(xì)菌可以復(fù)蘇并可在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)出來(lái)，這一些微生物將成為重要的微生物及微生物資源[6-7]。我們從潮間帶海水中分離培養(yǎng)得到的一株海洋紅細(xì)菌發(fā)酵液中，分離純化其胞外多糖，并對(duì)其理化性質(zhì)和初步結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行了測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-巖藻糖、D-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 (PMP，99%) 均為Sigma公司產(chǎn)品；不同分子量葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品Dextran (Ultra Pure, 美國(guó)Fluka公司)；標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白 (Ultra Pure，美國(guó)Sigma公司)，F(xiàn)olin酚試劑乙以及重蒸酚 (北京鼎國(guó)生物工程公司)；95%乙醇、丙酮、濃硫酸、無(wú)水乙醇、咔唑、硼砂、乙酰丙酮、對(duì)二苯氨基苯甲醛、二甲亞砜、吡啶、醋酸酐、氫化鈉、硼氫化鈉、二氯甲烷、肌醇六乙酸酯、酒石酸鉀鈉、碳酸鈉、硫酸銅、三氟乙酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (Cary 50，美國(guó)瓦里安公司)；高效液相色譜儀 (Waters 2695, 美國(guó)Waters公司)；快速蛋白質(zhì)液相色譜儀 (AKTA FPLC Pharmacia Biotech, Sweden)；在線紫外檢測(cè)器 (Uvicord SII Pharmacia Biotech, Sweden)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (R-215 BüCHI, Switzerland)；便攜式pH計(jì)(Five FG2, METTLER TOLEDO，Switzerland)；高速離心機(jī) (Centrifuge 5810，Eppendorf)；電熱恒溫真空干燥箱 (DHG-9123A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器有限公司)；超級(jí)恒溫槽 (SC-15，寧波新芝生物科技)；真空冷凍干燥機(jī) (美國(guó)LABCONCO，美國(guó))；G1362A型示差折光檢測(cè)器；氣相色譜儀 (450GC，美國(guó)瓦里安公司)；Shodex OHpak SB-804 HQ (8.0 mm×300 mm) (Shodex,Japan)；Eclipse XDB-C18 (4.6 μm×250 mm)，(Agilent Technologies, USA)；Jeol JNM-ECP超導(dǎo)核磁共振波譜儀 (600 MHz) (日本電子)。

1.3 菌株鑒定及胞外多糖提取

菌株經(jīng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)發(fā)酵后鑒定為好氧型革蘭氏陰性菌，菌體為不規(guī)則卵圓形，無(wú)鞭毛。基于16S rRNA進(jìn)化分析表明細(xì)菌屬于變形菌綱(Alphaproteobacteria)，玫瑰桿菌支系 (Roseobacter clade)。表型及系統(tǒng)發(fā)生分析最終確定屬紅色細(xì)菌科 (Rhodobacteraceae)，命名為L(zhǎng)entibacter algarum[8]。

細(xì)菌發(fā)酵液經(jīng)布氏漏斗雙層濾紙抽濾分離除去菌體及其中的粗雜質(zhì)，并用乙酸乙酯萃取分離小分子脂溶性物。將水相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約為原體積的1/10。再將預(yù)冷2 h的95%的乙醇緩慢加入到濃縮液中 (體積比4∶1)，邊加邊攪拌，有沉淀析出，把醇沉后的溶液放入冰箱中靜置過(guò)夜。傾出上層清液，沉淀部分用布氏漏斗三層濾紙抽濾，并依次用無(wú)水乙醇、丙酮數(shù)次脫水后于40 ℃烘干，將其溶于適量蒸餾水后的上清液置于截留分子量為3 500的透析袋中對(duì)蒸餾水透析2 d，電導(dǎo)率儀測(cè)試透析外液至恒定值時(shí)停止透析，將透析液濃縮冷凍干燥即得到胞外多糖粗品。

1.4 胞外多糖的分離純化

[9]進(jìn)行：將胞外多糖粗品采用離子交換色譜 (IEC) 純化，在AKTA FPLC快速蛋白純化系統(tǒng)上用 Q S.epharose FF柱進(jìn)行純化，用0–2 mol/L NaCl溶液線性洗脫，根據(jù)線性洗脫結(jié)果，確定NaCl梯度洗脫濃度并分別以0、0.1、0.5和1.0 mol/L NaCl洗脫，部分收集器收集各組分，硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量，490 nm檢測(cè)。

1.5 多糖的凝膠純化

參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行：選取樣品La0.1以Superdex 75凝膠柱進(jìn)一步純化，以0.2 mol/L NH4HCO3為流動(dòng)相，自動(dòng)部分收集，同時(shí)作樣品的凝膠純化曲線，為保證多糖純度，我們只取峰尖部分，得到純度較高的多糖樣品命名為L(zhǎng)a0.1-1。

1.6 分子量分析

參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行：采用Shodex SB804柱，流動(dòng)相為0.2 mol/L Na2SO4溶液，柱溫35 ℃，流速0.5 mL/min。進(jìn)樣量為20 μL，RI在線檢測(cè)。

1.7 多糖完全酸水解及PMP柱前衍生高效液相色譜分析 (HPLC)

參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行：將多糖樣品1 mg加2 mol/L TFA，在安瓿瓶中105 ℃密封降解6 h后，氮吹除去TFA。干燥后采用PMP衍生法對(duì)多糖水解得到的單糖樣品衍生后進(jìn)行高效液相色譜分析。液相以HPLC Column ZORBAX Eclipse XDB-C18柱進(jìn)行測(cè)定，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液∶乙腈=83∶17，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。根據(jù)出峰時(shí)間和峰面積比可知樣品的單糖組成和摩爾比。

1.8 含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[13-17]進(jìn)行：采用硫酸-苯酚法，以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定樣品的總糖含量。采用硫酸-咔唑法，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定糖醛酸的含量。Elson-Morgan法測(cè)氨基糖含量。采用Follin酚法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.9 甲基化分析

參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行：采用改良的 Hakomori法對(duì)得到的多糖 La0.1-1進(jìn)行甲基化分析。稱取1.0 mg減壓干燥后的多糖純品，加入1.0 mL二甲基亞砜，磁力攪拌至樣品完全溶解，快速加入100.0 mg干燥的NaH，充入N2密封后于室溫下反應(yīng)1 h，緩慢加入碘甲烷1.0 mL，繼續(xù)反應(yīng)1 h，最后加入1.0 mL水終止反應(yīng)。反應(yīng)液以氯仿萃取多次，合并萃取液，并以水洗滌氯仿層3次。甲基化后多糖經(jīng)減壓干燥，進(jìn)行紅外光譜分析以確定甲基化是否完全。

將甲基化后樣品完全酸水解，硼氫化鈉還原，醋酸酐乙?；玫揭阴；苌?，進(jìn)行氣質(zhì)分析 (GC-MS)。

1.10 核磁分析 (NMR)

參考文獻(xiàn)[19]進(jìn)行：取40.0 mg La0.1-1以0.5 mL D2O溶解，反復(fù)交換2次。最后以0.7 mL D2O將樣品溶于核磁管，加入一滴氘代丙酮作為內(nèi)標(biāo)，在23 ℃下，利用1H-NMR、13C-NMR等核磁技術(shù)對(duì)La0.1-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果

2.1 胞外粗多糖的提取及分離純化

胞外粗多糖的產(chǎn)量約為0.15 g/L，為純白色粉末，經(jīng)Q-Sepharose Fast Flow陰離子色譜柱分離純化后主要得到水洗和 0.1、0.5、1.0 mol/L NaCl洗脫4個(gè)組分，分別命名為L(zhǎng)a0、La0.1、La0.5和La1.0 (圖1和圖2)。

圖1 胞外粗多糖Q-Sepharose Fast Flow 離子交換梯度洗脫圖Fig. 1 Segment elution graph of crude polycaccharide in Q-Sepharose fast-flow column.

圖2 La0.1 Superdex 75 凝膠滲透洗脫圖Fig. 2 Permeation elution graph of the La0.1 in Superdex 75 column.

由于含量及純度等原因，選取含量最高的組分La0.1進(jìn)行下一步凝膠滲透色譜純化，收集主峰，命名為L(zhǎng)a0.1-1。純化后經(jīng)shodex SB804凝膠滲透色譜顯示峰形較為對(duì)稱，純度較高，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算，其分子量為12.0 kDa。

2.2 單糖組成分析

由單糖組成液相色譜圖 (圖3) 所示，La0.1-1的單糖組成較為簡(jiǎn)單，主要含有甘露糖，氨基葡萄糖和半乳糖。三者的摩爾比約為Man∶GlcN∶Gal=1.1∶1.0∶1.35。該組分單糖組成不含有酸性糖，而和很多細(xì)菌來(lái)源多糖相似，富含GlcN這類堿性糖，但在單糖組成上主要由甘露糖、氨基葡萄糖和半乳糖組成，且三者比例相似，在細(xì)菌來(lái)源多糖中較為少見(jiàn)。

2.3 含量分析

對(duì)多糖La0.1-1進(jìn)行理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，La0.1-1總糖含量為66.3%，氨基糖含量為25%，未檢測(cè)出糖醛酸。和中性多糖相比，La0.1-1總糖含量偏低，可能是由于樣品中氨基糖的含量過(guò)高，導(dǎo)致苯酚硫酸法比色時(shí)顏色偏淺，造成誤差較大。樣品中還含有8.1%的蛋白，對(duì)含量測(cè)定和結(jié)構(gòu)分析也造成一定的影響，蛋白是否為多糖結(jié)合蛋白仍需進(jìn)一步分析確定。

圖3 La0.1-1單糖組成的液相色譜圖Fig. 3 Monosaccharides of La0.1-1 in HPLC chromatography.

2.4 甲基化分析

為研究多糖中單糖之間的連接方式，采用改良的 Hakmoori法對(duì) La0.1-1多糖進(jìn)行甲基化分析。甲基化后的樣品經(jīng)完全酸水解并經(jīng)過(guò)還原后制備成乙?；苌?，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS) 進(jìn)行檢測(cè) (圖4)。

圖4 La0.1-1的氣質(zhì)聯(lián)用總離子流色譜圖Fig. 4 Total ion chromatogram of La0.1-1 on GC-MS.

結(jié)果表明，La0.1-1的連接方式較為復(fù)雜，存在Manp(1→，Galp(1→，→2)Manp(1→，→3)Galp(1→，→4)Manp(1→，→4)Galp(1→，→3,4)Galp(1→，→2,6)Manp(1→，→3,6)Galp(1→連接方式。各單糖具體連接方式和比例如表1所示。La0.1-1的連接方式主要以→2)Manp(1→，→3)Galp(1→為主，占總連接方式的40%以上，還含有少量的→4)Manp(1→，→4)Galp(1→連接方式。根據(jù)比例判斷，大約每五個(gè)糖存在一個(gè)分支，分支在→2)Manp(1→的O-6位和→3)Galp(1→的O-4或O-6位。該分析條件無(wú)法得到氨基糖相關(guān)的連接方式的信息。

2.5 核磁分析

為進(jìn)一步確定多糖的結(jié)構(gòu)，對(duì)La0.1-1 進(jìn)行了1H和13C NMR波譜分析。通過(guò)對(duì)氫譜分析 (圖5A所示發(fā)現(xiàn)，異頭質(zhì)子信號(hào)主要集中在4.4–4.7 ppm處。因此推測(cè)該多糖的構(gòu)型主要以 β構(gòu)型為主[20-21,12]。氫譜在2.0 ppm 處，出現(xiàn)了甲基的信號(hào)，碳譜 (圖5B 所示) 在175 ppm 處出現(xiàn)了大量的羰基信號(hào)，推測(cè)多糖中存在乙?；〈Ｍㄟ^(guò)和文獻(xiàn)比對(duì)，我們推測(cè)乙酰基取代主要發(fā)生在氨基葡萄糖上，為乙酰氨基葡萄糖[22]，甘露糖和半乳糖上應(yīng)該也有一定的乙酰基取代，取代位置可能為甲基化分析中的分支位點(diǎn)處，因?yàn)橐阴；稽c(diǎn)不能甲基化，最終結(jié)果和多糖分支處的甲基化結(jié)果一致。

通過(guò)和已知多糖核磁數(shù)據(jù)相互比對(duì)[23-24]，我們推斷104.3 ppm處的信號(hào)為→3)-β-D-Galp(1→的異頭碳信號(hào)。103.8 ppm處為→4)-β-D-Galp(1→的異頭碳信號(hào)。102.9 ppm處推測(cè)為→4)-β-D-GlcNAcp(1→的信號(hào)，101.5 ppm 處為→4)-β-D-Manp(1→的信號(hào)，100.6 ppm處 為→2)-D-Manp(1→的信號(hào)。99.0 ppm處可能為非還原末端GlcNAc或Gal的異頭碳信號(hào)。82.9 ppm處為→3)-β-D-Galp(1→的C3位信號(hào)。80.6 ppm處的兩 個(gè) 信 號(hào) 分 別 為 →4)-β-D-Galp(1→ 和→4)-β-D-GlcNAcp(1→的C4信號(hào)。78.0 ppm處可能為2位被取代的C2信號(hào)。62.0 ppm為未被取代C6位信號(hào)，而在67.0處的信號(hào)表明有部分C6被取代[25]，與甲基化結(jié)果相符合。56.0 ppm左右為氨基葡萄糖的C2位信號(hào)。

表1 細(xì)菌胞外多糖組分La0.1-1甲基化水解產(chǎn)物GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS results of the fraction La0.1-1 after methylation

圖5 La0.1-1的 1H譜(A)和 13C譜(B)Fig. 5 1H NMR (A) and 13C NMR (B) of La0.1-1.

雖然通過(guò)一維核磁的分析和比對(duì)能歸屬出大部分信號(hào)，但該多糖的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，具體連接順序的信息還需要進(jìn)步通過(guò)二維核磁來(lái)進(jìn)一步確定。

3 討論

對(duì)青島潮間帶海水中分離得到的一株海洋紅細(xì)菌Lentibacter algarumZXM100T 所產(chǎn)胞外多糖進(jìn)行了分離純化，對(duì)含量較高的組分 La0.1進(jìn)一步純化得到組分 La0.1-1，并對(duì)其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，La0.1-1主要由半乳糖、甘露糖和氨基葡萄糖組成，其摩爾比約為1.35∶1.1∶1.0，分子量約為12.0 kDa。通過(guò)甲基化分析和核磁分析表明，該多糖為存在少量分支的直鏈結(jié)構(gòu)。多糖連接方式主要為β構(gòu)型，其中半乳糖主要為→3)Galp(1→和少量的→4)Galp(1→連接，甘露糖主要為→2)Manp(1→和少量→4)Manp(1→連接，氨基葡萄糖主要為→4)GlcNAc(1→和末端連接方式。分支發(fā)生在→2)Manp(1→的 C6位或→3)Galp(1→C6和 C4位。核磁分析還發(fā)現(xiàn)該多糖存在一定的乙酰基取代，主要取代在氨基葡萄糖的C2位，可能還有一定取代發(fā)生在→3)Galp(1→的C4或C6位。雖然未確定La0.1-1的最終結(jié)構(gòu)，但初步分析表明該多糖的結(jié)構(gòu)具有一定的新穎性，因?yàn)橐园肴樘菫橹?，并同時(shí)含有大量甘露糖和氨基葡萄糖的多糖鮮有報(bào)道。該研究為海洋微生物胞外多糖的開(kāi)發(fā)利用提供了重要資料，也確定了海洋微生物是獲取結(jié)構(gòu)豐富多糖的重要資源。該多糖具體的結(jié)構(gòu)信息還有待進(jìn)一步研究，純度還需提高，減少蛋白對(duì)結(jié)構(gòu)和活性測(cè)定的影響，并進(jìn)行可能的生物活性篩選。

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