鵝MYL1基因的克隆及胚胎期表達(dá)特征分析

顧志良，邵 芳，石亦靜，吳小娟

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

動(dòng)物的產(chǎn)肉力與肌纖維細(xì)胞的數(shù)量和生長密切相關(guān)[1]，肌纖維是構(gòu)成骨骼肌的基本單位，肌球蛋白是肌纖維的主要成分之一，是一種多功能馬達(dá)蛋白，為肌肉收縮提供動(dòng)力.肌球蛋白是一個(gè)超家族，有2條肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MHC）和2條肌球蛋白輕鏈（Myosin light chian，MYL）組成.哺乳動(dòng)物存在兩對(duì)輕鏈，每對(duì)輕鏈由必需肌球蛋白輕鏈（Essential myosin light chain，ELC）和調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈（Regula?tory myosin light chain，RLC）組成[2]，不同的ELC和RLC的家族成員由多種基因編碼，而且同型異構(gòu)體可呈現(xiàn)不同的表達(dá)譜.肌球蛋白輕鏈、肌鈣蛋白C與鈣調(diào)蛋白同屬于EF-hand超家族成員，EF-hand是一種由40個(gè)左右氨基酸組成的螺旋-環(huán)-螺旋基序（Motif），環(huán)區(qū)通常是該類蛋白的Ca2+結(jié)合區(qū)域.肌球蛋白輕鏈能穩(wěn)定肌球蛋白的α-螺旋的頸部區(qū)域，并位于靠近肌球蛋白三磷酸腺苷結(jié)合和肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域[3].

肌球蛋白輕鏈1基因（myosin light chian1，MYL1）屬于ELC的一個(gè)成員，編碼肌球蛋白必須輕鏈亞基，主要在哺乳動(dòng)物的心肌、平滑肌和快肌表達(dá).哺乳動(dòng)物中，MYL1基因有MLC1f和MLC3f兩種異構(gòu)體，兩者之間的不同僅在于N-端的41個(gè)氨基酸[4-6].MLC1f和MLC3f的轉(zhuǎn)錄調(diào)控受到一系列調(diào)控元件控制，包括MLC1f和MLC3f的啟動(dòng)子元件和MEF2、MEF3等肌肉組織特異增強(qiáng)子元件[5，7-8].

鵝作為重要水禽，鵝肉具有營養(yǎng)豐富、脂肪含量低、不飽和脂肪酸含量高等優(yōu)點(diǎn)[9]，其產(chǎn)肉量和肌肉品質(zhì)都是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，關(guān)于鵝肌肉生長發(fā)育和肉質(zhì)形成的研究也備受人們關(guān)注.MYL1基因在肌肉生長發(fā)育過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用.然而鵝MYL1基因至今尚未被克隆和測(cè)序，鑒于該基因在肌肉發(fā)育過程中的重要意義，本研究將以太湖鵝為材料，采用3′-RACE和5′-RACE技術(shù)克隆鵝MYL1基因，對(duì)該基因序列作生物信息學(xué)分析，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MYL1基因在胚胎期的表達(dá)情況，旨在為該基因的功能和開展產(chǎn)肉性狀分子遺傳基礎(chǔ)研究積累素材.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

從常熟市江南畜禽食品公司孵化場(chǎng)采集E7、E10、E14、E15、E18、E21、E25和E28的太湖鵝胚各4枚，液氮速凍各組織后于-80℃保存.

1.2 總RNA的提取

用Trizol（Invitrogen，USA）分別提取E7，E10胚胎總RNA及E14、E15、E18、E21、E25和E28鵝胚腿肌總RNA，RNase-free dH2O充分溶解，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA質(zhì)量，NanoDrop2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，于-80℃保存?zhèn)溆?

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表的雞（登錄號(hào)：NM_001044632）和鴨（登錄號(hào)：HQ728349）MYL1基因序列設(shè)計(jì)鵝CDS區(qū)PCR引物.根據(jù)RT-PCR獲得的序列設(shè)計(jì)5′-RACE和3′-RACE的特異性引物（包括Outer PCR引物和Inner PCR引物），同時(shí)根據(jù)克隆獲得的MYL1基因cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，內(nèi)參用GAPDH，兩對(duì)引物均跨越內(nèi)含子，引物均由上海生工生物工程有限公司合成.引物的相關(guān)信息見表1.

表1 PCR引物的信息

1.4 鵝MYL1基因5′和3′端的序列擴(kuò)增及產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

5′端序列擴(kuò)增按 TaKaRa 5′-Full RACE Kit說明步驟，對(duì)鵝總 RNA（2 μg）進(jìn)行去磷酸化處理、“去帽子”反應(yīng)、5′RACE Adaptor連接得到ligated RNA，取6 μL ligated RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后再分別用MYL3-5′RACE Outer和Inner引物進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)；用DNA回收試劑盒（QIAEXⅡ）回收目的片段，回收產(chǎn)物與pMD-19T載體（TaKaRa）連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆，菌落PCR檢測(cè)，結(jié)果為陽性的菌液送上海生工公司測(cè)序.

3′端序列擴(kuò)增同樣按TaKaRa 3′-Full RACE Kit說明步驟，將鵝總RNA稀釋成500 ng/μL，取1 μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再分別用MYL1-3′RACE Outer和Inner引物進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，后續(xù)步驟同上.

1.5 不同胚胎發(fā)育時(shí)期MYL1 mRNA表達(dá)分析

將不同胚胎發(fā)育時(shí)期鵝總RNA稀釋成同一濃度（100 ng/μL），每個(gè)時(shí)期3個(gè)個(gè)體，取5 μL RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再運(yùn)用熒光定量 PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系總體積為 20 μL：SYBR Premix ExTaqTMII（2×）10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）0.4 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，cDNA 1 μL，RNase-free dH2O 7.8 μL；qRT-PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s 40次. 在AB（應(yīng)用生物系統(tǒng)）公司的7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行.

1.6 鵝MYL1基因生物信息學(xué)分析

利用在線工具DNAMAN和ClustalX1.83軟件做同源性比對(duì)，用MEGA 4.1軟件中的Kimura 2-parameter法計(jì)算凈遺傳距離矩陣，并以距離矩陣鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.通過ExPASy蛋白質(zhì)組服務(wù)器中的ProtParam工具預(yù)測(cè)鵝MYL1蛋白的理化性質(zhì).應(yīng)用NCBI上的“BLASTP”程序分析MYL1蛋白的功能屬性.

1.7 數(shù)據(jù)收集和分析

對(duì)不同鵝胚胎發(fā)育時(shí)期的樣品內(nèi)標(biāo)基因GAPDH和目標(biāo)基因MYL1分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，測(cè)定其Ct值，根據(jù)相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 2-ΔCt值法，算出每個(gè)樣品中GAPDH基因與MYL1基因表達(dá)的相對(duì)值.在Excel中作出MYL1mRNA不同發(fā)育時(shí)期腿肌組織中表達(dá)量的柱狀圖.并用SPSS軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié)果分析

2.1 鵝MYL1基因全長cDNA克隆及序列分析

通過同源比對(duì)設(shè)計(jì)特異性引物，以鵝肌肉總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，用引物MYL1outer F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得長度為450 bp左右片段（圖1）.經(jīng)過3′RACE和5′RACE各兩輪PCR后，分別獲得1000 bp和500 bp的特異性條帶（圖2）.克隆測(cè)序后用DNAMAN5.0軟件進(jìn)行序列拼接，去除重疊序列，得到1 542 bp的鵝MYL1cDNA全序列.包含582 bp的開放性閱讀框，其起始密碼子為AUG，終止密碼子為UGA，共翻譯編碼193個(gè)氨基酸，5′-UTR為108 bp，3′-UTR為852 bp（圖2），GenBank登錄號(hào)：KF986326.

圖1 鵝MYL1基因cDNA擴(kuò)增(M：DL-2000 DNA marker)

2.2 鵝MYL1基因生物信息學(xué)分析

通過ExPASy蛋白質(zhì)組服務(wù)器中的ProtParam工具分析鵝MYL1預(yù)測(cè)蛋白的生理生化特征，其等電點(diǎn)為5.12，分子量為21.75 KD，由3633個(gè)原子組成，分子式為C964H1528N252O297S11，負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)為36（Asp+Glu），正電荷氨基酸殘基總數(shù)為 28（Arg+Lys），不穩(wěn)定系數(shù)為43.18.通過ProtScale工具分析其親疏水性，發(fā)現(xiàn)最小值為-3.000，位于第16個(gè)氨基酸殘基，具有高親水性，而最大值為1.144，位于第116個(gè)氨基酸殘基，有較強(qiáng)的疏水性.進(jìn)一步分析親疏水性區(qū)域，在5～33，50，64，64，99～102，125～127，165，166等區(qū)域具有高親水性（score<-1.5）（圖 3）. 利用NCBI上 Blasp預(yù)測(cè)鵝MYL1蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示MYL1含有一個(gè)典型的EFh（EF-hand， calcium binding motif） 和 FRQ1（Ca2+-binding protein，EF-hand superfami?ly）保守結(jié)構(gòu)域（圖4），這兩種結(jié)構(gòu)都是鈣結(jié)合蛋白位點(diǎn)，這與其他肌球蛋白輕鏈基因結(jié)構(gòu)相似.

圖2 鵝MYL1基因全長cDNA的核苷酸及氨基酸序列

圖3 鵝MYL1基因氨基酸親疏水性圖譜

2.3 鵝MYL1系統(tǒng)發(fā)育分析

通過DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，鵝MYL1基因CDS區(qū)序列與鴨同源性最高為98.28%，與哺乳類同源性在66%左右；進(jìn)一步比對(duì)氨基酸序列，與鴨的氨基酸同源性高達(dá)100%，與哺乳類的MLC1f同源性在65%～69%，由于相差40個(gè)氨基酸殘基，所以與哺乳類的MLC3f同源性較低，僅在55%左右（見表2）.利用MEGA 4.1軟件構(gòu)建包括紅原雞、爪蟾、小鼠等9個(gè)物種的分子進(jìn)化樹.結(jié)果表明哺乳類聚成一支，鵝與鴨聚為一支，自展值為100（圖5）.不同物種MYL1系統(tǒng)發(fā)育與物種間的親緣關(guān)系及形態(tài)分類基本一致.

圖4 鵝MYL1蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 鵝MYL1mRNA胚胎表達(dá)分析

表2 鵝與其他物種MYL1基因編碼區(qū)的同源性比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，鵝胚胎期MYL1基因mRNA表達(dá)量總體呈現(xiàn)上升后下降的趨勢(shì)，該基因在E7就有表達(dá)，E7以后表達(dá)量逐漸上升，在E18表達(dá)量達(dá)到高峰后下降（圖6）.通過SPSS軟件進(jìn)一步分析不同日齡的鵝胚腿肌MYL1基因mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)E18與E14、E28差異顯著（P<0.05）.

3 討論

肌球蛋白輕鏈?zhǔn)羌∏虻鞍椎囊粋€(gè)亞基.肌球蛋白輕鏈擁有自己的肽鏈，這點(diǎn)與重鏈不同.它們不被包括在肌球蛋白家族中，但對(duì)形成肌球蛋白酶催化超分子復(fù)合體有重要作用.輕鏈基因有：MYL1、MYL2、MYL3、MYL4、MYL5、MYL6等基因，分ELC和RLC兩種類型，不同的ELC和RLC的家族成員由多種基因編碼，而且同型異構(gòu)體可呈現(xiàn)出不同的表達(dá)譜.在哺乳動(dòng)物ELC家族中，MYL1在快骨骼肌中表達(dá)；MYL3（ELCv）主要在心室和慢骨骼肌中表達(dá)；MYL4（ELCa）在胎兒和成體的心房以及骨骼肌中表達(dá)；MYL6在平滑肌中表達(dá).在RLC家族中，MYL2（MLC2v or RLCv）在心室中表達(dá)，MYL7（MLC2a or RLCa）在心房中表達(dá)；MYL5在骨骼肌中表達(dá)；MYL9在平滑肌中表達(dá).一般認(rèn)為肌球蛋白輕鏈對(duì)肌肉的收縮有調(diào)節(jié)作用，但研究認(rèn)為在橫紋肌中這種調(diào)節(jié)作用很弱[10-11].

圖5 不同物種推導(dǎo)的MYL1氨基酸序列構(gòu)建的NJ樹

圖6 鵝MYL1基因在不同胚胎發(fā)育時(shí)期腿肌中表達(dá)量

多個(gè)哺乳動(dòng)物MYL1基因由不同的啟動(dòng)子調(diào)控，存在MLC1f和MLC3f兩種異構(gòu)體，并且這兩種異構(gòu)體出現(xiàn)在胚胎形成的不同時(shí)期中：在小鼠中，MLC1f轉(zhuǎn)錄體是從胚胎骨骼肌的分化時(shí)期（E9）開始積累，而MLC3f轉(zhuǎn)錄體從胚胎骨骼肌E13.5～E15時(shí)期開始大量積累[12].在小鼠的胚胎肌肉發(fā)育階段，MLC1f、MLC3f表達(dá)方式是相互獨(dú)立的，即在胚胎發(fā)育不同時(shí)期出現(xiàn)[13]，并認(rèn)為MYL1基因的表達(dá)是快肌纖維出現(xiàn)的特征[14].同樣的發(fā)現(xiàn)MYL1基因在斑馬魚胚胎發(fā)育早期就有表達(dá)，早于其他已知快肌蛋白標(biāo)志，并發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受到MyoD和Myf5基因的調(diào)控[15].Ling等鑒定了豬MYL1基因mRNA 5個(gè)選擇性剪切體（MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C），并在豬背最長肌中首次鑒定出了MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C 3個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，MLC1f、MLC3f在骨骼肌和心肌中高表達(dá)，而三個(gè)新轉(zhuǎn)錄本僅僅在骨骼肌中表達(dá)；發(fā)現(xiàn)除了剪切體MLC1f外，其余轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量均為隨個(gè)體體重的增加而逐步增加，到成年時(shí)表達(dá)量迅速增至最高[7].

本研究通過RACE技術(shù)首次克隆獲得鵝MYL1基因全長1542 bp的cDNA序列，包含582 bp的開放性閱讀框，編碼含193個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，堿基序列及蛋白質(zhì)前體氨基酸序列與其他物種高度同源，并與MYL1f基因同源性更高，推測(cè)我們克隆的為MYL1f基因，至于鵝是否存在MYL3f基因有待于進(jìn)一步研究.對(duì)鵝MYL1蛋白序列進(jìn)行功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)其編碼氨基酸殘基包含一個(gè)典型的EFh和FRQ1這兩個(gè)結(jié)合鈣蛋白保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)MYL1基因與鈣離子結(jié)合密切相關(guān)，是一種鈣結(jié)合蛋白.通過熒光定量檢測(cè)MYL1基因在不同發(fā)育時(shí)期腿肌中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因在胚胎早期就有表達(dá)，并在E18天表達(dá)量達(dá)到高峰.說明胚胎早期就有肌肉的形成和發(fā)育.

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