根瘤菌BK-20固定化細(xì)胞生產(chǎn)L(+)-酒石酸

蘭翔，鮑文娜，潘海峰，謝志鵬，張建國(guó)浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)研究所，浙江 杭州 310058

根瘤菌BK-20固定化細(xì)胞生產(chǎn)L(+)-酒石酸

蘭翔，鮑文娜，潘海峰，謝志鵬，張建國(guó)
浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)研究所，浙江 杭州 310058

順式環(huán)氧琥珀酸水解酶(CESH)是根瘤菌BK-20生產(chǎn)L(+)-酒石酸的關(guān)鍵酶。為提高其生產(chǎn)效率和生產(chǎn)穩(wěn)定性，首先優(yōu)化根瘤菌BK-20的產(chǎn)酶條件，然后利用固定化細(xì)胞連續(xù)生產(chǎn)L(+)-酒石酸。結(jié)果顯示，優(yōu)化后游離細(xì)胞酶活達(dá)(3 498.0±142. 6) U/g，較優(yōu)化前提高643%。固定化細(xì)胞酶活達(dá)(2 817.2±226.7) U/g，其最適包埋劑、菌體濃度和凝膠濃度分別為海藻酸鈉，10% (W/V)和1.5% (W/V)。固定化細(xì)胞連續(xù)反應(yīng)10批后，其形狀和酶活均無(wú)明顯改變，單批次轉(zhuǎn)化率達(dá)98%以上，具有良好的生產(chǎn)穩(wěn)定性。

順式環(huán)氧琥珀酸水解酶，L(+)-酒石酸，根瘤菌，優(yōu)化，細(xì)胞固定化

L(+)-酒石酸為天然小分子有機(jī)酸，最初是從葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物酒石中提煉得到，在食品、化工、制藥、紡織以及電鍍等多行業(yè)具有十分廣泛的用途[1-4]。目前酒石酸的主流生產(chǎn)方法是利用特異微生物產(chǎn)生的立體選擇特異性順式環(huán)氧化物水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase, CESH)直接水解順式環(huán)氧琥珀酸(鹽)，產(chǎn)生L(+)-酒石酸。該方法因操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高且無(wú)副產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。因此，含有CESH的微生物菌種的篩選和酶活力的提高成為該方法的關(guān)鍵。1974年，日本佐藤英次等首次建立了利用無(wú)色桿菌Achromobacter tartarogens來(lái)水解順式環(huán)氧琥珀酸鹽生產(chǎn)L(+)-酒石酸的技術(shù)路線；近年來(lái)，潘克俠,潘海峰等[5-6]分別篩選出產(chǎn)CESH的紅球菌Rhodococcus rubber M1和博德特氏菌Bordetella sp. BK-52，細(xì)胞酶活力分別可達(dá)750 U/g和764 U/g，用于生產(chǎn)L(+)-酒石酸取得了良好的效果。

在發(fā)酵工業(yè)中人們常常利用細(xì)胞固定化技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酶細(xì)胞的穩(wěn)定高效利用。張建國(guó)等[7-8]從土壤中分離到的一株產(chǎn)CESH的棒狀桿菌Corynebacterium JZ-1，對(duì)該菌進(jìn)行細(xì)胞固定化處理后，實(shí)現(xiàn)酶活回收率達(dá)100%以上。孫志浩等[9-11]篩選到一株諾卡氏菌Nocardia tartaricans SW 13-57, 其固定化細(xì)胞酶活力達(dá)120 U/g，將其用于L(+)-酒石酸的生產(chǎn)也獲得了成功。

本文采用單因子試驗(yàn)對(duì)一株產(chǎn)CESH酶的根瘤菌(編號(hào)為根瘤菌BK-20)進(jìn)行了產(chǎn)酶條件的初步優(yōu)化與細(xì)胞固定化技術(shù)的初步研究，為該菌進(jìn)行L(+)-酒石酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供初步的試驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室保存的一株具有產(chǎn)CESH酶能力的根瘤菌(編號(hào)根瘤菌BK-20)。

1.1.2 初始培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[12]；

初始培養(yǎng)基：順式環(huán)氧琥珀酸二鈉10 g/L，葡萄糖10 g/L，硝酸銨1 g/L，玉米漿5 mL/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L。

初始培養(yǎng)條件：種齡24 h，初始pH 7.0，裝液量25%，接種量1%，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酶條件和細(xì)胞固定化條件的優(yōu)化

以O(shè)D600和細(xì)胞酶活力為測(cè)定指標(biāo)，采用單因子試驗(yàn)依次對(duì)培養(yǎng)基主要組分、培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到高酶活細(xì)胞后進(jìn)行固定化，并考察其相關(guān)技術(shù)參數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞固定化方法

分別稱(chēng)取1.5 g瓊脂、明膠、κ-卡拉膠溶于20 mL蒸餾水，于45 ℃保溫，分別與約3 g濕細(xì)胞(終濃度10%)的10 mL生理鹽水懸浮液混勻，于4 ℃冷卻凝固后切成3 mm×3 mm×3 mm的小塊；另取約2 g濕細(xì)胞(終濃度10%)用5 mL生理鹽水懸浮后，與15 mL 2%海藻酸鈉溶液混勻，用7號(hào)針頭滴入0.1 mol/L CaCl2溶液中形成直徑3 mm的小球，然后依次在2%聚乙烯亞胺溶液中浸泡30 min，1%戊二醛溶液中浸泡60 s進(jìn)行交聯(lián)強(qiáng)化處理，防止其在底物中發(fā)生溶解。獲得固定化細(xì)胞后依次用蒸餾水和生理鹽水沖洗后，取相當(dāng)于0.1 g濕細(xì)胞的固定化細(xì)胞，測(cè)定酶活力和酶活回收率。

1.2.3 酶活的測(cè)定

取約0.1 g濕細(xì)胞，于5 mL 1 mol/L的順式環(huán)氧琥珀酸二鈉溶液 (pH 8.0)，30 ℃振蕩反應(yīng)1 h，離心取上清測(cè)酒石酸含量，計(jì)算酶活。一個(gè)酶活力單位定義為：1 g濕細(xì)胞1 h內(nèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1 μmol酒石酸所需的酶量，單位用U/g表示。

酒石酸的含量采用偏釩酸銨比色法[13]來(lái)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基主要組分的優(yōu)化

依次對(duì)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑、碳源、無(wú)機(jī)和有機(jī)氮源的種類(lèi)及其濃度進(jìn)行了優(yōu)化，綜合考察菌體生長(zhǎng)情況和細(xì)胞酶活力水平。結(jié)果如圖1所示。最終確定該根瘤菌BK-20的最適誘導(dǎo)劑、最適碳源、最適無(wú)機(jī)和有機(jī)氮源分別為：L(+)-酒石酸鈉、蔗糖、氯化銨和玉米漿。分別對(duì)其最適濃度進(jìn)行考察后，確定L(+)-酒石酸鈉、蔗糖、氯化銨和玉米漿的最適濃度分別為：5 g/L、1 g/L、0.5 g/L和1 mL/L。首次發(fā)現(xiàn)L(+)-酒石酸鈉對(duì)該菌產(chǎn)CESH的誘導(dǎo)作用大于順式環(huán)氧琥珀酸鈉的誘導(dǎo)作用。

2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

依次對(duì)種齡、初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)、裝液量、接種量等因素進(jìn)行考察。綜合考察菌體生長(zhǎng)情況和細(xì)胞酶活力水平。最終確定該根瘤菌BK-20的最適培養(yǎng)條件為：種齡36 h，初始pH 8.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)24 h，裝液量10%，接種量1%。

使用優(yōu)化后培養(yǎng)基，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終獲得細(xì)胞酶活達(dá) (3 498.0±142.6) U/g，較優(yōu)化前的細(xì)胞酶活 (462.6±52.5) U/g提高了643%。

2.3 細(xì)胞固定化條件的優(yōu)化

2.3.1 固定化載體的選擇

使用不同載體對(duì)根瘤菌BK-20進(jìn)行固定化處理(表1)。相同細(xì)胞濃度條件下，用海藻酸鈉包埋后的固定化細(xì)胞表現(xiàn)出最高的酶活力和酶活回收率水平，且顯著高于其他載體，這可能與聚乙烯亞胺和戊二醛的滲透強(qiáng)化處理有關(guān)，驗(yàn)證了金同立等[14]的研究結(jié)果。

圖1 不同誘導(dǎo)劑(A)、碳源(B)、無(wú)機(jī)氮源(C)、有機(jī)氮源(D)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和酶活力的影響Fig. 1 Effect of different inducers (A), carbon sources (B), inorganic nitrogen (C), organic nitrogen (D) on cell growth and enzyme activity.

表1 不同載體對(duì)固定化細(xì)胞酶活力及酶活回收率的影響Table 1 Effect of different embedding carriers on enzyme activity and recovery of enzyme activity

2.3.2 固定化細(xì)胞的最適菌體濃度和凝膠濃度

依次考察不同菌體濃度和凝膠濃度對(duì)固定化細(xì)胞酶活力的影響，結(jié)果如圖2所示。固定化細(xì)胞的酶活力在菌體濃度為10% (W/V)時(shí)達(dá)最大(2 813.3±256.4) U/g，菌體濃度超過(guò)10%后，過(guò)高的菌體包埋率可能產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)[15]，使得固定化細(xì)胞的酶活力開(kāi)始下降；而海藻酸鈉的濃度為1.5% (W/V)時(shí)，固定化細(xì)胞的酶活達(dá)最大(2 767.6± 261.1) U/g?？梢?jiàn)，凝膠濃度過(guò)小，則固定化細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞泄露損失；凝膠濃度過(guò)大，則固定化細(xì)胞內(nèi)部空間縮小，限制了酶活力的發(fā)揮。因此，選擇固定化細(xì)胞的最適菌體濃度和最適凝膠濃度分別為10%和1.5%。在此條件下制備固定化細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終獲得固定化細(xì)胞的最大酶活力為(2 817.2±226.7) U/g。

圖2 不同菌體濃度(A)、凝膠濃度(B)對(duì)固定化細(xì)胞酶活力的影響Fig. 2 Effect of different cell concentrations (A), gel concentrations (B) on enzyme activity of immobilized cells.

2.3.3 固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性

取1 g固定化細(xì)胞于20 mL 1 mol/L底物(pH 8.0) 中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，單批次摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)98%以上。連續(xù)反應(yīng)10批后，固定化細(xì)胞的形狀和酶活力都沒(méi)有明顯改變；將固定化細(xì)胞浸泡在生理鹽水中，于4 ℃冰箱貯藏60 d后，其酶活力依然達(dá)到(2 514.7±174.3) U/g，沒(méi)有顯著下降，證明其具有良好的生產(chǎn)穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文首次對(duì)根瘤菌BK-20順式環(huán)氧琥珀酸水解酶(CESH)的產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步優(yōu)化，得到此株根瘤菌BK-20的較合適培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件：L(+)-酒石酸鈉5 g/L，蔗糖1 g/L，氯化銨0.5 g/L，玉米漿1 mL/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.5 g/L；種齡36 h，初始pH 8.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)24 h，裝液量10%，接種量1%。并首次發(fā)現(xiàn)，L(+)-酒石酸鈉對(duì)該菌產(chǎn)CESH的誘導(dǎo)作用大于順式環(huán)氧琥珀酸鈉的誘導(dǎo)作用。優(yōu)化后，細(xì)胞酶活力可達(dá)(3 498.0±142.6) U/g，較優(yōu)化前提高643%。

本文也首次對(duì)該根瘤菌BK-20的細(xì)胞固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了以海藻酸鈉作為最適固定化載體，最適菌體濃度和最適載體濃度分別為10%和1.5%；獲得的固定化細(xì)胞保持了較高的酶活力(2 817.2±226.7) U/g，單批次轉(zhuǎn)化率達(dá)98%以上，并且表現(xiàn)出優(yōu)良的生產(chǎn)穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性，證明此株根瘤菌BK-20具有一定的L(+)酒石酸工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Production of L(+)-tartaric acid by immobilized Rhizobium strain BK-20

Xiang Lan, Wenna Bao, Haifeng Pan, Zhipeng Xie, and Jianguo Zhang
Institute of Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang, China

The cis-epoxysuccinate hydrolase (CESH) from Rhizobium strain BK-20 is the key enzyme for L(+)-tartaric acid production. To establish a highly efficient and stable production process, we first optimized the enzyme production from Rhizobium strain BK-20, and then developed an immobilized cell-culture process for sustained production of L(+)-tartaric acid. The enzyme activity of free cells reached (3 498.0±142.6) U/g, and increased by 643% after optimization. The enzyme activity of immobilized cells reached (2 817.2±226.7) U/g, under the optimal condition with sodium alginate as carrier, cell concentration at 10% (W/V) and gel concentration at 1.5% (W/V). The immobilized cells preserved high enzyme activity and normal structure after 10 repeated batches. The conversion rate of the substrate was more than 98%, indicating its excellent production stability.

CESH, L(+)-tartaric acid, Rhizobium, optimization, cell immobilization

June 17, 2013; Accepted: September 4, 2013

Zhipeng Xie. Tel/Fax: +86-571-88206983; E-mail: xzp@zju.edu.cn

蘭翔, 鮑文娜, 潘海峰, 等. 根瘤菌BK-20固定化細(xì)胞生產(chǎn)L(+)-酒石酸. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(2): 315-319.

Lan X, Bao WN, Pan HF, et al. Production of L(+)-tartaric acid by immobilized Rhizobium strain BK-20. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 315-319.

時(shí)間：2013-12-06 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20131206.0847.004.html