豬bmp15基因報(bào)告載體的構(gòu)建及其特異性

秦明鳴，魏江華，俞曉麗，張景龍，劉曉鵬，馬曉玲，王華巖 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 700 陜西萬盛肉類加工有限公司，陜西 楊凌 700

豬bmp15基因報(bào)告載體的構(gòu)建及其特異性

秦明鳴1，魏江華2，俞曉麗1，張景龍1，劉曉鵬1，馬曉玲1，王華巖1
1 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100 2 陜西萬盛肉類加工有限公司，陜西 楊凌 712100

為了研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白15 (bmp15) 基因的表達(dá)和調(diào)控特性，通過克隆豬bmp15基因2.2 kb啟動(dòng)子片段，構(gòu)建pBMP15-EGFP報(bào)告載體，實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞向類卵母細(xì)胞分化的過程。以豬卵巢組織和中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)、成肌細(xì)胞 (C2C12)、豬羊水干細(xì)胞 (pAFSC) 為材料，通過RT-PCR、免疫熒光、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、顯微注射檢測(cè)bmp15組織特異性表達(dá)，并且通過單層細(xì)胞誘導(dǎo)檢測(cè)該基因體外示蹤類卵母細(xì)胞獲得過程的能力。RT-PCR結(jié)果顯示bmp15在豬的卵巢組織中特異表達(dá)，在CHO中表達(dá)，而在C2C12和pAFSC中不表達(dá)。卵巢組織切片免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示bmp15表達(dá)于卵泡發(fā)育的各個(gè)階段。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子只在CHO中有活性，而在C2C12和pAFSC中均無活性。顯微注射重組質(zhì)粒片段結(jié)果顯示增強(qiáng)綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorecence Protein，EGFP) 在卵母細(xì)胞體外成熟18 h啟動(dòng)表達(dá)，并能夠持續(xù)至4-細(xì)胞期胚胎。單層細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果顯示誘導(dǎo)12 d的pAFSC出現(xiàn)攜帶EGFP的圓形細(xì)胞團(tuán)。說明bmp15具有表達(dá)特異性和示蹤干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為類卵母細(xì)胞的潛能。

豬，bmp15，啟動(dòng)子，基因表達(dá)，豬羊水干細(xì)胞

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15 (Bone morphogenetic protein 15，Bmp15) 是一種自分泌生長因子，與生長分化因子9 (Grow differential factor 9，Gdf9) 同屬于TGFβ家族成員，在早期卵泡的生長發(fā)育及排卵過程中起重要作用[1]。bmp15與gdf9都是卵母細(xì)胞發(fā)育的特異性基因，它們之間具有高度相似的結(jié)構(gòu)[2]，都在卵母細(xì)胞成熟和受精過程中發(fā)揮重要的作用[3]。Bmp15與顆粒細(xì)胞上BMPRII型受體結(jié)合，使促卵泡雌激素(Follicle-stimulating hormone, FSH) 受體表達(dá)下調(diào)，因此抑制了依賴FSH的StAR、P450scc等基因的表達(dá)，顯示了抑制黃體化的作用[4]。對(duì)Bmp15的相關(guān)研究能夠使研究者更好地理解生殖細(xì)胞發(fā)生發(fā)育分化過程的分子機(jī)制，為體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞 (Embroyonic stem cell, ESC) 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (Induced pluripotent stem cell, iPSC) 向生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化提供了理論基礎(chǔ)。

目前，用ESC、iPSC和成體干細(xì)胞 (Adult stem cell, ASC) 誘導(dǎo)原始生殖細(xì)胞的研究取得了一定進(jìn)展[5-8]，誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞已具有獲得成活的小鼠后代的能力[9]。為了示蹤并驗(yàn)證不同時(shí)期雌性生殖細(xì)胞的產(chǎn)生，一系列與生殖細(xì)胞相關(guān)的EGFP啟動(dòng)子報(bào)告載體被構(gòu)建出來，其中有Oct4-EGFP[8]、Gdf9-EGFP[10]、Dazl-EGFP[11]和Figlα-EGFP[12]等。因此，利用bmp15基因的EGFP啟動(dòng)子報(bào)告載體可作為體外獲取卵母細(xì)胞的潛在標(biāo)記。

羊水干細(xì)胞是存在于胎兒羊水中的多能性干細(xì)胞，來源于胎兒組織[13]。這些細(xì)胞呈Oct4陽性，同時(shí)表達(dá)部分成體干細(xì)胞標(biāo)記，具有強(qiáng)大的增殖能力和向三胚層分化的潛能[14]，可在體外分化為脂肪細(xì)胞[15]、跳動(dòng)樣心肌細(xì)胞等[16]，是一種具有重要研究價(jià)值的新型干細(xì)胞。本研究通過檢測(cè)bmp15的組織表達(dá)特異性、構(gòu)建啟動(dòng)子報(bào)告載體、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、顯微注射等技術(shù)手段，檢測(cè)重組質(zhì)粒的活性，并用于誘導(dǎo)豬羊水干細(xì)胞向類卵母細(xì)胞分化過程的示蹤。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer Sequences

1 材料與方法

1.1 菌種、載體及細(xì)胞

大腸桿菌DH5α，質(zhì)粒pEGFP-1、pEGFP-C1，中國倉鼠卵巢細(xì)胞 (CHO)、小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)、豬羊水干細(xì)胞 (Porcine amniotic fluid stem cell，pAFSC) 由陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心保存。豬卵母細(xì)胞 (Porcine oocyte，pO)采集于陜西萬盛肉類加工有限公司的屠宰場(chǎng)。pGEM-T Easy載體購自Promega公司。

1.2 試劑及耗材

總RNA提取試劑盒、基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、多聚賴氨酸處理載玻片等常規(guī)試劑，均購自天根公司；DNA marker購自BioLabs公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq聚合酶均購自Fermentas 公司；Opti-MEM、α-MEM、DMEM和M199培養(yǎng)基均購自Invitrogen 公司；FSH、孕馬血清促性腺激素 (PMSG)、人絨毛膜促性腺激素 (HCG) 均購自寧波第二激素廠；非必需氨基酸 (NEAA)、L-谷氨酰胺 (L-Glu)、β-巰基乙醇 (β-ME)、陽離子脂質(zhì)體 (Lipofectamine 2000)、胎牛血清 (FBS)、表皮生長因子 (EGF)購自Gibco公司；兔抗Bmp15抗體和羊抗兔Cy3二抗均購自Abcam 公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 RT-PCR檢測(cè)bmp15在成年豬組織和幾種細(xì)胞系中的表達(dá)特異性

從成年豬卵巢、睪丸、胃、肝臟、肌肉、腎臟、心臟、胸腺、肺臟組織中提取總RNA，同時(shí)提取CHO、C2C12、pAFSC和pO的總RNA；反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用RT-PCR方法檢測(cè)bmp15在成年豬組織和幾種細(xì)胞系中的表達(dá)特異性 (表1)。

1.4 免疫組織化學(xué)法定位豬卵巢組織內(nèi)Bmp15表達(dá)

取成年豬卵巢組織，用4%多聚甲醛固定并用石蠟包埋，常規(guī)方法制作2 μm石蠟切片。將石蠟切片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上。經(jīng)60 ℃烘片5–6 h，進(jìn)行免疫熒光染色：切片以二甲苯脫蠟及梯度酒精復(fù)水；用0.01 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液加熱至沸騰進(jìn)行抗原修復(fù)；以5% BSA室溫封閉30 min；加入兔抗Bmp15抗體4 ℃過夜；PBS pH 7.2–7.4，洗片5 min，重復(fù)洗3次加稀釋的羊抗兔Cy3二抗工作液，37 ℃孵育30 min；PBS 洗片5 min，重復(fù)洗3次加入DAPI染核1 min；PBS 洗片5 min，重復(fù)洗3次通過水洗、脫水、透明、中性樹膠封片，在熒光顯微鏡下觀察照相。

1.5 豬bmp15啟動(dòng)子片段的分子克隆及報(bào)告載體的構(gòu)建

從豬卵巢組織提取基因組DNA，在豬的bmp15基因序列 (GenBank Accesion No. 448811) 的上游區(qū)域設(shè)計(jì)啟動(dòng)子引物，在設(shè)計(jì)好的引物上游加入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，下游加入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn) (表1)?？寺￠L度為2.2 kb (-2 166～+0)的bmp15啟動(dòng)子片段。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，并與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒與pEGFP-1使用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和Hind Ⅲ酶切，膠回收連接后轉(zhuǎn)化，挑取單克隆菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶SacⅠ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pBMP15-EGFP。

1.6 豬bmp15啟動(dòng)子在不同細(xì)胞系中的表達(dá)活性檢測(cè)

將陽性對(duì)照pEGFP-C1和構(gòu)建好的pBMP15-EGFP報(bào)告載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于24孔板培養(yǎng)皿中的CHO、C2C12、pAFSC。轉(zhuǎn)染前1 d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h加入0.5 mL含5%血清的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理。取0.8 μg pBMP15-EGFP和50 μL無血清的稀釋液Opti-MEM混合，2 μL脂質(zhì)體與50 μL Opti-MEM混合；5 min后，將上述兩種混合物混合 (總體積100 μL)，輕輕混合均勻，在室溫下孵育25 min，加入含有適量新鮮培養(yǎng)液的細(xì)胞中；放入37 CO℃2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4–6 h后更換含10% 血清的新鮮培養(yǎng)液；轉(zhuǎn)染24 h后用熒光顯微鏡觀察。

1.7 豬bmp15啟動(dòng)子在卵母細(xì)胞中的表達(dá)活性檢測(cè)

從屠宰場(chǎng)收集豬卵巢，32–38 ℃保存在含有青霉素和鏈霉素的生理鹽水中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用抽吸法采集卵巢卵母細(xì)胞，用含青霉素和鏈霉素的生理鹽水沖洗卵巢3–5次，然后抽取3–6 mm卵泡中的豬卵泡液 (Porcine follicle fluid, pFF) 置于離心管中，37 ℃水浴靜置數(shù)分鐘，待卵子沉降后，收取豬卵泡液，離心過濾備用。將卵母細(xì)胞用洗卵液洗兩遍，實(shí)體顯微鏡下挑取胞質(zhì)均勻、顆粒細(xì)胞層達(dá)兩層以上的顆粒細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合物 (Cumulus oocyte complex，COC)，COC分別在預(yù)熱的洗卵液和成熟培養(yǎng)液中各洗3次，之后在培養(yǎng)箱中孵育2 h，取出用0.3%透明質(zhì)酸酶溶液脫去顆粒細(xì)胞。將重組質(zhì)粒用XhoⅠ和NotⅠ酶切，獲得pBMP15-EGFP啟動(dòng)子報(bào)告基因片段，通過膠回收純化處理后注射入脫顆粒的卵母細(xì)胞中，于18 h時(shí)觀察卵母細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)情況。之后孤雌激活的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2–3 d后觀察卵裂情況，用熒光顯微鏡觀察卵裂細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)。

1.8 豬bmp15啟動(dòng)子在重編程細(xì)胞中的檢測(cè)

將P10–P15代的pAFSC接種至12孔培養(yǎng)板中，在38 ℃、5% CO2條件下用羊水干細(xì)胞培養(yǎng)液 (α-MEM+ 10% FBS+ 2 mmol/L L-Glu+ 100 U/mL青霉素+ 100 U/mL鏈霉素) 培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到60%–70%匯合度時(shí)，用胰酶消化后，將細(xì)胞接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液換為羊水干細(xì)胞誘導(dǎo)液(α-MEM+ 5% pFF+ 5% FBS+ 1 mmol/L NEAA+ 1% β-ME+ 1 mmol/L L-Glu+ 1.5 μmol/L EGF)。此時(shí)記為0 d，隔天換液，培養(yǎng)12 d，觀察誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)變化并對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pBMP15-EGFP質(zhì)粒的細(xì)胞綠色熒光進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 豬bmp15組織和細(xì)胞表達(dá)特異性及內(nèi)源Bmp15在卵巢組織中的定位

采用RT-PCR方法對(duì)豬的卵巢、睪丸、胃、肝臟、肌肉、腎臟、心臟、胸腺、肺臟等9種組織進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，bmp15具有組織表達(dá)特異性，只在卵巢組織中高表達(dá)，而在其他組織中低表達(dá)或不表達(dá) (圖1A)。對(duì)不同來源的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在豬卵母細(xì)胞以及CHO中表達(dá)，而在C2C12和pAFSC中不表達(dá)，顯示了bmp15在不同細(xì)胞中的表達(dá)特異性 (圖1B)。

通過免疫熒光方法對(duì)豬卵巢組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與未加一抗的陰性對(duì)照組 (圖2D) 相比，初級(jí)卵泡 (圖2A)、次級(jí)卵泡 (圖2B)和成熟卵泡 (圖2C) 中均可觀察到bmp15陽性細(xì)胞的存在，說明Bmp15蛋白表達(dá)。這一結(jié)果顯示Bmp15存在于卵泡發(fā)育的各個(gè)階段。

2.2 豬bmp15啟動(dòng)子片段的克隆及pBMP15-EGFP重組質(zhì)粒的篩選和鑒定

以豬卵巢組織提取的基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到約2.2 kb的片段 (圖3A)。DNA片段測(cè)序結(jié)果通過BLAST比對(duì)表明，克隆序列與預(yù)期片段相同，說明克隆的片段為豬bmp15序列的上游啟動(dòng)子片段。將此啟動(dòng)子片段上傳NCBI獲得GenBank登錄號(hào)為KF114861。與報(bào)告載體pEGFP-1連接的重組質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶SacⅠ和Hind Ⅲ雙酶切獲得1 kb和5.3 kb兩個(gè)片段，結(jié)果與預(yù)期相符 (圖3B)，說明重組報(bào)告載體構(gòu)建成功，命名為pBMP15-EGFP (圖3C)。

圖1 骨形成蛋白15在豬不同組織和細(xì)胞系中的表達(dá)Fig. 1 RT-PCR analysis of bmp15 expression in porcine tissues and different cells. (A) Nine porcine tissues. 1-9: ovary, testis, stomach, liver, muscle, kidney, heart, thymus and lung. (B) 1-4: pO, CHO, pAFSC and C2C12.

圖2 免疫熒光檢測(cè)Bmp15在豬卵巢組織中的表達(dá)Fig. 2 Immunofluorescence assay of Bmp15 expression in porcine ovary. (A) Primary follicle. (B) Secondary follicle. (C) Matured follicle. (D) Negative control without primary antibody. 1: Bmp15 staining; 2: nucleus staining with DAPI; 3: the merged images.

圖3 bmp15啟動(dòng)子片段克隆及報(bào)告載體構(gòu)建Fig. 3 Subclone and construction of bmp15 reporter vector. (A) PCR product of bmp15 promoter. (B) SacⅠand Hind Ⅲ digestion of the recombinant plasmid. M: DNA marker. (C) The recombinant plasmid.

2.3 pBMP15-EGFP在不同細(xì)胞系和卵母細(xì)胞中的活性檢測(cè)

將重組載體pBMP15-EGFP及陽性對(duì)照載體pEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染CHO、C2C12、pAFSC等細(xì)胞中，24 h后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組載體及陽性對(duì)照載體的CHO細(xì)胞均有表達(dá)EGFP陽性細(xì)胞的存在 (圖4A、4D)。在C2C12和pAFSC中，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1的細(xì)胞均能檢測(cè)到EGFP的表達(dá) (圖4B、4C)，而轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞均未觀察到EGFP陽性細(xì)胞的存在 (圖4E、4F)。這說明bmp15啟動(dòng)子在CHO中有活性，而在成肌細(xì)胞和豬羊水干細(xì)胞中沒有活性。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證啟動(dòng)子片段在卵母細(xì)胞中的活性，將XhoⅠ和NotⅠ雙酶切獲得BMP15-EGFP片段，顯微注射入去顆粒細(xì)胞的GV期卵母細(xì)胞中。結(jié)果顯示，在卵母細(xì)胞體外成熟至18 h時(shí)，綠色熒光出現(xiàn)在大多數(shù)卵母細(xì)胞中 (圖5A)。將注射有DNA片段的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外激活，發(fā)育至2-4細(xì)胞時(shí)仍可以檢測(cè)到微弱的綠色熒光，說明Bmp15在卵母細(xì)胞體外成熟過程中發(fā)揮功能作用 (圖5B、5C)。在未注射BMP15-EGFP片段的GV期豬卵母細(xì)胞(圖5D)、2-細(xì)胞期胚胎 (圖5E) 和4-細(xì)胞期胚胎 (圖5F) 中，均未檢測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)。

圖4 pBMP15-EGFP重組質(zhì)粒在不同細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè)Fig. 4 Identification of bmp15 promoter activity in different cell lines after the transient transfection. (A) CHO cells with pEGFP-C1. (B) pAFSC with pEGFP-C1. (C) C2C12 cells with pEGFP-C1. (D) CHO cells with pBMP15-EGFP. (E) pAFSC with pBMP15-EGFP. (F) C2C12 cells with pBMP15-EGFP. 1: light images; 2: fluorescence images.

圖5 BMP15-EGFP片段顯微注射入豬卵母細(xì)胞Fig. 5 Microinjection of the BMP15-EGFP DNA fragment into porcine oocyte. (A) BMP15-EGFP in matured oocytes in vitro for 18 h. (B) BMP15-EGFP in 2-cell embryos. (C) BMP15-EGFP in 4-cell embryos. (D) Negative control in matured oocytes in vitro for 18 h. (E) Negative control in 2-cell embryos. (F) Negative control in 4-cell embryos. 1: light images; 2: fluorescence images.

2.4 pBMP15-EGFP重組質(zhì)粒在pAFSC誘導(dǎo)分化過程中的示蹤作用

羊水干細(xì)胞在誘導(dǎo)液中培養(yǎng)，使其向類卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。為了示蹤分化過程，將pBMP15-EGFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入誘導(dǎo)的類卵母細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白。結(jié)果顯示，經(jīng)過誘導(dǎo)的豬羊水干細(xì)胞在誘導(dǎo)過程中細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞形態(tài)由原來的成纖維樣轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形。誘導(dǎo)12 d，可見培養(yǎng)皿中存在大量的圓形細(xì)胞團(tuán)，直徑在40–60 μm左右(圖6A)，綠色熒光在圓形細(xì)胞團(tuán)中表達(dá) (圖6B)，團(tuán)塊中存在可見多個(gè)細(xì)胞核 (圖6C)，呈現(xiàn)出類似卵母細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

圖6 pBMP15-EGFP示蹤pAFSC誘導(dǎo)分化Fig. 6 pBMP15-EGFP monitoring the differentiation of pAFSC into OLCs after 12 days induction. (A) The OLCs. (B) The GFP expression after transient transfect pBMP15-EGFP into OLCs. (C) DAPI staining. (D) The merge image.

3 討論

Bmp15和Gdf9具有相似的結(jié)構(gòu)，同屬于TGFβ家族成員。但是，與其他TGFβ超家族成員不同的是，Bmp15和Gdf9均缺乏保守序列中7個(gè)半胱氨酸中的第4個(gè)半胱氨酸殘基，而該半胱氨酸與蛋白質(zhì)的二硫鍵形成有關(guān)，因此它們通常以單體、異源二聚體或同源二聚體等形式發(fā)揮作用[18]。豬bmp15在組織中的表達(dá)分布主要集中在卵母細(xì)胞中，而gdf9除在卵母細(xì)胞中表達(dá)外，也可以在豬的其他組織中檢測(cè)到。顯然，bmp15的組織特異性更強(qiáng)，這可能與豬的bmp15基因定位于X染色體上有某種關(guān)系[19]。

CHO細(xì)胞系是中國倉鼠卵巢上皮細(xì)胞，可單層貼壁培養(yǎng)，具有卵巢組織的特異性，因此作為陽性參照細(xì)胞。C2C12是小鼠成肌細(xì)胞，作為陰性參照細(xì)胞，而作為實(shí)驗(yàn)組的pAFSC，則驗(yàn)證bmp15啟動(dòng)子是否具有在該細(xì)胞內(nèi)工作的能力。結(jié)果顯示，此啟動(dòng)子不能在C2C12和pAFSC工作，這與預(yù)期相符。綠色熒光蛋白僅在CHO中有表達(dá)，可能因?yàn)榉N屬差異造成表達(dá)量較低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證啟動(dòng)子的工作能力，顯微注射BMP15-EGFP片段至體外成熟的卵母細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)成熟18 h時(shí)可見明顯綠色熒光，這與Li等實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。他們檢測(cè)到Bmp15在體外成熟18 h的豬卵母細(xì)胞中表達(dá)量達(dá)到峰值，之后表達(dá)量逐漸減弱[17]。體外成熟至2–4細(xì)胞期的孤雌胚胎，綠色熒光蛋白的表達(dá)也隨著胚胎發(fā)育而減弱。豬卵母細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育過程轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也顯示，豬Bmp15在卵母細(xì)胞時(shí)期的表達(dá)量要高于胚胎期的表達(dá)量 (數(shù)據(jù)未發(fā)表)。

之前的實(shí)驗(yàn)證明，小鼠胚胎干細(xì)胞在體外先分化為原始生殖細(xì)胞，之后通過誘導(dǎo)產(chǎn)生類卵母細(xì)胞[20]。這一分化潛能通過減數(shù)分裂相關(guān)基因的檢測(cè)而進(jìn)一步加以證明[21]。除此之外，豬的皮膚干細(xì)胞在卵泡液誘導(dǎo)下也能生出具有卵母細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，人的羊水干細(xì)胞也具有向卵母細(xì)胞誘導(dǎo)分化的潛能，并在此過程中bmp15基因被激活[22]。這些都為bmp15作為生殖細(xì)胞標(biāo)記提供了基礎(chǔ)。通過誘導(dǎo)豬羊水干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)12 d的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了bmp15啟動(dòng)子作為報(bào)告載體的可行性。

本實(shí)驗(yàn)證明了bmp15在豬不同組織中的表達(dá)特異性，并構(gòu)建了pBMP15-EGFP報(bào)告載體，驗(yàn)證在不同成體細(xì)胞和豬卵母細(xì)胞中的表達(dá)能力，成功構(gòu)建了可追蹤體外誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的報(bào)告載體，為開展干細(xì)胞體外向卵母細(xì)胞誘導(dǎo)分化奠定了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction and specificity of porcine bmp15 gene reporter vector

Mingming Qin1, Jianghua Wei2, Xiaoli Yu1, Jinglong Zhang1, Xiaopeng Liu1, Xiaoling Ma1, and Huayan Wang1
1 College of Veterinary Medicine, Shaanxi Center of Stem Cells Engineering and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China 2 Shaanxi Wansheng Meat Processing Co., Ltd., Yangling 712100, Shaanxi, China

The aim of this study is to identify the express specificity of bone morphogenetic protein 15 (Bmp15) in porcine. The pBMP15-EGFP reporter vector was constructed from the 2.2 kb fragment of porcine bmp15 promoter to trace the differentiation process of stem cells into oocyte-like cells. We used porcine ovary and Chinese Hamster Ovary cell line (CHO), mouse myoblast cell line (C2C12) and porcine amniotic fluid stem cell (pAFSC) to investigate the expression and regulation of this gene via RT-PCR, immunofluorescence, cell transfection, and microinjection methods. We also used single layer cell differentiation to detect the application potential of bmp15. The results show that bmp15 gene was specifically expressed in the porcine ovary and CHO rather than in C2C12 and pAFSC. In addition, the characteristic of tissue-specific of Bmp15 was detected on CHO instead of other cell lines by transient transfection. We also detected the expression of Bmp15 in oocyte at different development stages by immunofluorescence of fixed paraffin-embedded ovary sections. Furthermore, microinjection results show that bmp15 expressed in oocytes at 18 h of maturation in vitro, and continued up to 4-cell stage embryos. Most importantly, we found that the expression of Bmp15 started at day 12 after inducing pAFSC into oocyte-like cells by transfection; green fluorescent was visible in round cell masses. It indicated that bmp15 has the expression specificity and the pBMP15-EGFP reporter vector can be used to trace Bmp15 action in the differentiation of stem cells into germ cells.

porcine, bone morphogenetic protein 15, promoter, gene expression, porcine amniotic fluid stem cell

May 4, 2013; Accepted: June 22, 2013

Huayan Wang. Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com

秦明鳴, 魏江華, 俞曉麗, 等. 豬bmp15基因報(bào)告載體的構(gòu)建及其特異性. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(2): 203-212.

Qin MM, Wei JH, Yu XL, et al. Construction and specificity of porcine bmp15 gene reporter vector. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 203-212.

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2009CB941002).

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973 計(jì)劃) (No. 2009CB941002) 資助。

時(shí)間：2013-08-16 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130816.1715.005.html