高精度相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的新進(jìn)展

馬首智，孫玉琳，趙曉航，徐平

高精度相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的新進(jìn)展

馬首智1，孫玉琳1，趙曉航1，徐平2,3

1 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院 分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021 2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850 3 北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206

蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸從定性研究轉(zhuǎn)向定量研究。在定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中，相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽 (Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) 是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，具有通量高、穩(wěn)定性強(qiáng)及不受樣品來(lái)源制約等優(yōu)點(diǎn)，幾乎可以對(duì)任意樣品進(jìn)行標(biāo)記，而且可以同時(shí)對(duì)多達(dá)8個(gè)樣品進(jìn)行定量分析，有效地提高了通量。iTRAQ技術(shù)不斷改進(jìn)，其定量準(zhǔn)確性顯著提高，適用的平臺(tái)越來(lái)越多，為微生物、動(dòng)物、植物、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾組研究創(chuàng)造了條件。文中綜述了高精度iTRAQ技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的最新發(fā)展及其應(yīng)用。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)，相對(duì)和絕對(duì)定量的等量異位標(biāo)簽，定量精確度

蛋白質(zhì)組學(xué)是一門新興學(xué)科，主要目的是從整體水平上研究蛋白的組成及其生物學(xué)功能。與傳統(tǒng)生物學(xué)研究針對(duì)單個(gè)蛋白不同，蛋白質(zhì)組學(xué)同時(shí)研究數(shù)千乃至上萬(wàn)個(gè)蛋白在特定生物學(xué)過(guò)程中的變化。高等生物蛋白質(zhì)組具有高度的動(dòng)態(tài)范圍和復(fù)雜性，給蛋白質(zhì)組學(xué)研究帶來(lái)了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的生物化學(xué)技術(shù)無(wú)法滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需求，需要新技術(shù)的有力支撐。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步可以推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展，每一次重大的技術(shù)突破都會(huì)改變蛋白質(zhì)組學(xué)研究的面貌。其中，iTRAQ是近年來(lái)新出現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)定量技術(shù)。自誕生以來(lái)，iTRAQ技術(shù)得到了不斷改進(jìn)，在不同領(lǐng)域有了廣泛的應(yīng)用。

1 iTRAQ技術(shù)原理

iTRAQ是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司 (Applied biosystems Inc, ABI) 的Ross等[1]于2004年發(fā)展的一種用于體外標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽的試劑。以4標(biāo)試劑盒為例，該組試劑由4種相同分子量的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽 (Isobaric tag) 組成。每個(gè)標(biāo)簽包括肽反應(yīng)基團(tuán) (Reactive group)、平衡基團(tuán)(Balance group)和報(bào)告基團(tuán) (Reporter group) 等3部分 (圖1A)。肽反應(yīng)基團(tuán)可與多肽的N端或賴氨酸側(cè)鏈的ε氨基共價(jià)連接。報(bào)告基團(tuán)的分子量分別為114、115、116、117道爾頓 (Da)，平衡基團(tuán)分別為31、30、29、28 Da。每個(gè)iTRAQ試劑的報(bào)告基團(tuán)和平衡基團(tuán)分子量加和相等，所以不同iTRAQ試劑標(biāo)記的多肽在一級(jí)質(zhì)譜中分子量沒(méi)有差異，這種設(shè)計(jì)不僅可以增強(qiáng)質(zhì)譜信號(hào)，還可有效地減少混合樣品的復(fù)雜性。在二級(jí)質(zhì)譜中，這3個(gè)基團(tuán)之間發(fā)生斷裂，平衡基團(tuán)由于中性丟失不能被檢測(cè)；報(bào)告基團(tuán)可以被質(zhì)譜檢測(cè)到，因而可以用報(bào)告基團(tuán)區(qū)分樣品的來(lái)源。由于這些不同樣品來(lái)源但相同質(zhì)荷比的母離子可被選擇進(jìn)行高能碰撞裂解，釋放出代表來(lái)源樣品的不同質(zhì)荷比的報(bào)告離子和完全一致的子離子系列。這些子離子系列包含有氨基酸序列信息，可用于蛋白質(zhì)鑒定。而這些在同一個(gè)二級(jí)譜圖中包含的報(bào)告離子的豐度代表了不同來(lái)源樣品中該特定蛋白的多少，可用于蛋白質(zhì)定量分析。

2 iTRAQ技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)

iTRAQ技術(shù)因其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，問(wèn)世后受到了蛋白質(zhì)組學(xué)界的廣泛關(guān)注，并在應(yīng)用中得以不斷地改進(jìn)和優(yōu)化。iTRAQ技術(shù)包括了3個(gè)方面的發(fā)展趨勢(shì)，即通量不斷提高、適用的質(zhì)譜平臺(tái)逐漸增加以及iTRAQ的定量準(zhǔn)確性顯著改善。

2.1 iTRAQ通量的提高

Pierce等[2]通過(guò)對(duì)分子結(jié)構(gòu)的改進(jìn)，設(shè)計(jì)出可以同時(shí)標(biāo)記8個(gè)樣品的iTRAQ試劑，具體結(jié)構(gòu)并未公開(kāi)(圖1B)。與iTRAQ原理類似的試劑還有Thermo公司的串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記(Tandem mass tags, TMT)試劑[3]。TMT試劑可以同時(shí)標(biāo)記6個(gè)樣品(圖1C)。不同標(biāo)記試劑對(duì)蛋白鑒定的影響不同。Pichler等[4]研究發(fā)現(xiàn)在相同條件下，4重iTRAQ試劑鑒定的蛋白最多，其次是TMT試劑，8重iTRAQ試劑鑒定的蛋白最少。這主要是因?yàn)椴煌膇TRAQ試劑分子量不同，8重iTRAQ試劑加到肽段上的分子量更高，產(chǎn)生的譜圖更復(fù)雜，導(dǎo)致常用的搜庫(kù)軟件，如Mascot、Sequest等搜索后給出的匹配結(jié)果變差，質(zhì)譜譜圖分值低，因而在質(zhì)控過(guò)濾時(shí)更容易被過(guò)濾掉。因此在相同的假陽(yáng)性率條件下，8重iTRAQ試劑鑒定到的蛋白數(shù)量最少。

與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記(Stable isotope labeling of amino acids in culture，SILAC)技術(shù)相比，iTRAQ技術(shù)可以同時(shí)分析的樣品更多。最近美國(guó)威斯康辛大學(xué)的Coon研究小組發(fā)展出一種基于中子編碼(Neutron encoding，NeuCode)的多重蛋白質(zhì)組定量技術(shù)，它考慮了由穩(wěn)定同位素原子核結(jié)合能變異引起的細(xì)微質(zhì)量差異，可根據(jù)這種細(xì)微的質(zhì)量差異實(shí)現(xiàn)不同標(biāo)簽標(biāo)記的區(qū)分和定量比較。將NeuCode指紋引入SILAC技術(shù)，即發(fā)展為NeuCode SILAC[5]。以賴氨酸為例，這一技術(shù)理論上可以達(dá)到39重標(biāo)記。它結(jié)合了iTRAQ技術(shù)高通量和SILAC技術(shù)高精度兩方面的優(yōu)點(diǎn)，可能是未來(lái)iTRAQ技術(shù)發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。

2.2 iTRAQ檢測(cè)平臺(tái)的發(fā)展

早期iTRAQ標(biāo)記的樣品使用飛行時(shí)間質(zhì)譜(Time of flight，TOF) 進(jìn)行檢測(cè)。而在離子阱質(zhì)譜(Ion trap, IT)中應(yīng)用較晚，這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)的離子阱質(zhì)譜使用碰撞誘導(dǎo)解離 (Collsion induced dissociation, CID) 技術(shù)，由于四分之一效應(yīng)的存在，同時(shí)也由于低質(zhì)荷比端噪音高，無(wú)法檢測(cè)低質(zhì)荷比區(qū)域的iTRAQ報(bào)告離子。Griffin等[6]引入了脈沖Q點(diǎn)裂解 (Pulsed Q dissociation, PQD) 技術(shù)，使IT質(zhì)譜可用于iTRAQ報(bào)告離子的檢測(cè)。更高能量碰撞解離 (Higher-energy collisional dissociation, HCD) 技術(shù)[7]的引入擴(kuò)展了IT質(zhì)譜的檢測(cè)范圍，并且提高了質(zhì)譜分析精度。

2.3 iTRAQ定量準(zhǔn)確性的改善

iTRAQ技術(shù)發(fā)展的另一個(gè)趨勢(shì)是不斷提高蛋白定量的準(zhǔn)確性。蛋白定量時(shí)目標(biāo)蛋白產(chǎn)生的報(bào)告離子容易受到雜質(zhì)離子產(chǎn)生的報(bào)告離子的干擾，導(dǎo)致定量準(zhǔn)確性降低。最近2篇發(fā)表在Nature Methods上的工作采用新的質(zhì)譜方法進(jìn)行iTRAQ分析，試圖解決這個(gè)問(wèn)題。其中，Wenger等[8]將一級(jí)質(zhì)譜的目標(biāo)離子進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移解離(Electron transfer dissociation，ETD)處理，ETD處理改善了定量效果，但并沒(méi)有完全去除干擾離子對(duì)定量的影響。在另一項(xiàng)研究中，Ting等[9]將蛋白用LysC酶解后進(jìn)行標(biāo)記，二級(jí)質(zhì)譜采用CID裂解但并不進(jìn)行定量分析，而是選擇信號(hào)最強(qiáng)的帶有報(bào)告離子的碎片離子再進(jìn)行第三級(jí)HCD裂解，通過(guò)三級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的報(bào)告離子進(jìn)行定量。因?yàn)殡s質(zhì)產(chǎn)生的碎片離子與樣品產(chǎn)生的碎片離子質(zhì)荷比不同，所以很少有干擾離子能夠進(jìn)入三級(jí)質(zhì)譜，從而使目標(biāo)離子的定量準(zhǔn)確度得到提高。使用已知比值(10∶1)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，當(dāng)沒(méi)有雜質(zhì)離子干擾時(shí)，蛋白的中位比值為11.7∶1，而有雜質(zhì)離子干擾時(shí)，蛋白中位比值變?yōu)?.7∶1。如果采用三級(jí)質(zhì)譜方法，蛋白的中位比值可恢復(fù)為10.5∶1。這說(shuō)明三級(jí)質(zhì)譜方法幾乎徹底去除了干擾離子對(duì)定量的影響，有效地提高了定量蛋白質(zhì)組的精度。

三級(jí)質(zhì)譜技術(shù)出現(xiàn)后，又得到了不斷的優(yōu)化。Dayon等[10]通過(guò)將三級(jí)質(zhì)譜與氣相分離結(jié)合，并換用胰酶進(jìn)行酶解，進(jìn)一步提高了蛋白鑒定數(shù)量。三級(jí)質(zhì)譜方法的質(zhì)譜周期較長(zhǎng)。對(duì)此，Wühr等[11]發(fā)展了互補(bǔ)TMT(Complement TMT, TMTc)的方法，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜中TMT試劑部分?jǐn)嗔训漠a(chǎn)物進(jìn)行定量，這些離子含有肽段和未充分裂解的TMT試劑，殘余的TMT試劑含有穩(wěn)定同位素，可以區(qū)分樣品來(lái)源并提供定量信息。這種方法可以在不增加質(zhì)譜分析時(shí)間的情況下準(zhǔn)確定量，但并非所有的二級(jí)質(zhì)譜圖都含有合適的TMTc離子。

2.4 mTRAQ技術(shù)的引入

相對(duì)和絕對(duì)定量的不等量標(biāo)簽(Mass differential tags for relative and absolute quantification，mTRAQ)技術(shù)是與iTRAQ原理類似的一種技術(shù)。與iTRAQ的差別在于mTRAQ技術(shù)的標(biāo)簽并不等重(圖1D、E、F)。mTRAQ設(shè)計(jì)的最初目的是用于質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple reaction monitoring, MRM)分析，研究發(fā)現(xiàn)mTRAQ也適合鳥槍法測(cè)序[12]。隨后對(duì)質(zhì)譜、生物信息等技術(shù)的改進(jìn)提升了mTRAQ分析的質(zhì)量[13-14]，擴(kuò)展了mTRAQ技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。使用2-甲氧基-4,5-二氫-1氫-咪唑也可以對(duì)酶解后的肽段進(jìn)行不等量標(biāo)記[15]。

3 iTRAQ技術(shù)與其他技術(shù)的比較

蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)包括基于凝膠的定量技術(shù)和基于質(zhì)譜的定量技術(shù)。近年來(lái)，基于質(zhì)譜的定量技術(shù)逐漸成為主流?；谫|(zhì)譜的定量技術(shù)可分為3類：代謝標(biāo)記技術(shù) (Metabolic labeling)、化學(xué)標(biāo)記技術(shù) (Chemical labeling)、無(wú)標(biāo)記定量技術(shù) (Label free)。3種方法的主要區(qū)別是對(duì)同位素標(biāo)簽的使用不同。以SILAC為代表的代謝標(biāo)記技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)階段加入同位素。以iTRAQ技術(shù)為代表的化學(xué)標(biāo)記技術(shù)對(duì)抽提的蛋白和多肽進(jìn)行同位素標(biāo)記。無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)則不使用同位素標(biāo)簽。不同標(biāo)記技術(shù)各有其優(yōu)缺點(diǎn) (表1)。

SILAC技術(shù)要求細(xì)胞在同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間，不能在體外分裂的細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行SILAC標(biāo)記。iTRAQ技術(shù)可以對(duì)肽段進(jìn)行體外標(biāo)記，因此對(duì)樣品來(lái)源沒(méi)有限制。此外，不同iTRAQ標(biāo)記的肽段在一級(jí)質(zhì)譜時(shí)形成一個(gè)峰，有利于蛋白鑒定。Pütz等[16]比較了iTRAQ和SILAC技術(shù)，結(jié)果表明iTRAQ鑒定到的蛋白和差異蛋白數(shù)量更多。與SILAC相比，iTRAQ的缺點(diǎn)是蛋白經(jīng)過(guò)酶解后再進(jìn)行標(biāo)記，這個(gè)過(guò)程使得從蛋白質(zhì)提取到消化為肽段的樣品處理過(guò)程無(wú)法監(jiān)控，可能引入人為干擾，增加了實(shí)驗(yàn)誤差，影響定量比較的精度。而傳統(tǒng)iTRAQ技術(shù)準(zhǔn)確度較差，更加劇了這種定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究的難度。

無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)質(zhì)譜穩(wěn)定性有嚴(yán)格要求，穩(wěn)定性差的質(zhì)譜平臺(tái)難以得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的定量信息。使用iTRAQ技術(shù)可以降低對(duì)質(zhì)譜的要求，而且提高了通量。例如，Wang等[17]比較了iTRAQ技術(shù)與非標(biāo)記定量技術(shù)，iTRAQ的變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV)只有1.8%，而無(wú)標(biāo)記定量的CV值達(dá)到了15.6%，但在測(cè)量變化倍數(shù)高的蛋白時(shí)，傳統(tǒng)的iTRAQ的準(zhǔn)確性低于無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)。Li等[18]系統(tǒng)比較了代謝標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記(iTRAQ/TMT)和無(wú)標(biāo)記定量技術(shù)。結(jié)果表明，代謝標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記的定量準(zhǔn)確度、精確度和可重復(fù)性相當(dāng)，而就定量精確性和可重復(fù)性來(lái)說(shuō)，iTRAQ/TMT技術(shù)還優(yōu)于代謝標(biāo)記技術(shù)。但盡管如此報(bào)道，由于代謝標(biāo)記的理論定量精度更高，因此需要更為細(xì)致、精確的評(píng)價(jià)。由于不同的技術(shù)方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的定量方法。

表1 不同蛋白定量方法比較Table 1 Comparasion of different quantification methods

4 iTRAQ技術(shù)的應(yīng)用

隨著技術(shù)的進(jìn)步，iTRAQ得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。iTRAQ技術(shù)用于蛋白定量分析，在微生物、動(dòng)物、植物、生物醫(yī)學(xué)等生物材料中都有應(yīng)用；此外，iTRAQ還可以用于蛋白翻譯后修飾研究。

4.1 iTRAQ技術(shù)用于微生物材料

微生物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，蛋白成分復(fù)雜度低，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的理想工具。大腸桿菌是最早應(yīng)用iTRAQ技術(shù)的模式生物之一[19]。此后，iTRAQ在微生物研究中的應(yīng)用不斷深入。Wang等[17]分析了高產(chǎn)油的衣藻和親本衣藻蛋白的差別，發(fā)現(xiàn)在高產(chǎn)油的衣藻中，參與脂肪酸合成的蛋白上調(diào)，而參與淀粉合成的蛋白下調(diào)，從而促進(jìn)了油脂的生成。Rivera等[20]分析了轉(zhuǎn)錄因子CodY對(duì)葡萄球菌毒力的影響。iTRAQ分析表明CodY敲除后葡萄球菌的蛋白酶和溶血素表達(dá)升高，增加了細(xì)菌的毒力。Lee等[21]分析了膽汁鹽處理前后約氏乳桿菌蛋白質(zhì)組變化，發(fā)現(xiàn)差異蛋白涉及脅迫響應(yīng)、細(xì)胞分裂、碳水化合物代謝等，這有助于益生菌改造。此外，Komatsu等[22]將mTRAQ技術(shù)用于微生物研究，發(fā)現(xiàn)了抗菌蛋白histatin 5調(diào)控白色念珠菌線粒體蛋白質(zhì)組的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。此外，宏蛋白質(zhì)組指微生物群落所產(chǎn)生的全部蛋白質(zhì)[23]，iTRAQ還可以用于宏蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

4.2 iTRAQ技術(shù)用于動(dòng)物材料

動(dòng)物樣本難以直接進(jìn)行代謝標(biāo)記。在模式動(dòng)物的研究中，iTRAQ可以有效解決樣品標(biāo)記的難題。有機(jī)汞對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染，Cuello等[24]用iTRAQ技術(shù)分析了甲基汞處理前后的斑馬魚蛋白質(zhì)組變化，發(fā)現(xiàn)71個(gè)表達(dá)改變的蛋白，分析結(jié)果表明甲基汞影響了胚胎發(fā)育、蛋白合成、能量代謝、鈣離子穩(wěn)態(tài)等。Sun等[25]用iTRAQ技術(shù)分析了高血壓疾病模型小鼠和正常小鼠的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)ATP6-VOA1、ATP6V1D、DLD、MAO-A等4個(gè)蛋白可以有效區(qū)分疾病小鼠和正常對(duì)照。

4.3 iTRAQ技術(shù)用于植物材料

植物生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常遭受惡劣環(huán)境，抗逆反應(yīng)可以幫助植物對(duì)抗惡劣環(huán)境，對(duì)抗逆反應(yīng)的研究有助于提高作物產(chǎn)量。Abdalla等[26]分析了抗旱植物維柯薩對(duì)脫水脅迫的響應(yīng)，作者用模擬脫水的藥物處理植物，提取了處理前后的細(xì)胞核，使用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行定量分析，鑒定到的差異蛋白涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核漿轉(zhuǎn)運(yùn)、分子伴侶等。Alvarez等[27]分析了脫落酸(Abscisic acid, ABA)處理的擬南芥GPA1突變體蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示ABA信號(hào)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)有重要的聯(lián)系，而GPA1既在ABA信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，也有獨(dú)立于ABA信號(hào)的其他功能。

4.4 iTRAQ技術(shù)用于生物醫(yī)學(xué)材料

人體組織或體液是生物標(biāo)記物的主要來(lái)源。人體組織樣本或體液樣本無(wú)法在體外分裂或擴(kuò)增，而且來(lái)源有限，極為珍貴，因此iTRAQ是一種理想的標(biāo)記技術(shù)，在組織樣本的研究中得到了廣泛應(yīng)用。

Zeng等[28]檢測(cè)了肺癌、轉(zhuǎn)移癌、不典型增生和正常組織的蛋白表達(dá)，鑒定到102個(gè)顯著變化的蛋白。后期的研究選取GSTP1、HSPB1和 CKB三個(gè)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明這3個(gè)蛋白的組合對(duì)不同病變區(qū)分的靈敏度和特異度均超過(guò)90%。Mangé等[29]從接受透析治療的患者血漿中分離高密度脂蛋白的復(fù)合體，使用iTRAQ技術(shù)鑒定相互作用蛋白，鑒定到apoC-Ⅱ、apoC-Ⅲ、serotransferrin和haptoglobin等幾個(gè)蛋白，這些蛋白可以預(yù)測(cè)患者接受透析治療時(shí)出現(xiàn)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

Kang等[30]采用mTRAQ技術(shù)從結(jié)腸癌和癌旁組織中鑒定到超過(guò)3 500個(gè)蛋白。此外，mTRAQ技術(shù)還可用于血清、福爾馬林固定樣品中蛋白的鑒定[31-32]。mTRAQ與MRM技術(shù)相結(jié)合，也常用于腫瘤標(biāo)志物的靶向研究[33-34]。

4.5 iTRAQ技術(shù)用于蛋白質(zhì)翻譯后修飾

翻譯后修飾對(duì)蛋白功能有重要的調(diào)控作用，iTRAQ結(jié)合特定的富集技術(shù)，可用于翻譯后修飾研究。Reiter等[35]純化了氧化應(yīng)激條件下酵母的Pan1蛋白，酶解后用iTRAQ試劑進(jìn)行標(biāo)記，再富集磷酸化修飾多肽，結(jié)果表明Pan1的磷酸化修飾受到氧化應(yīng)激的調(diào)控。Tian等[36]用固相萃取的方法純化血清糖基化修飾蛋白，并比較了侵襲性和非侵襲性前列腺癌患者血清糖基化修飾蛋白。結(jié)果表明Cathepsin L、Periostin和MFAP4等蛋白在侵襲性腫瘤里表達(dá)升高，這些蛋白可以作為診斷侵襲性前列腺癌的標(biāo)志物。Melo-Braga等[37]用不同的親和介質(zhì)富集各種翻譯后修飾蛋白，結(jié)合iTRAQ標(biāo)記和質(zhì)譜檢測(cè)，同時(shí)分析了蛋白表達(dá)譜、磷酸化修飾、糖基化修飾和乙?；揎椀淖兓Ｋ麄儚男【矶昵秩镜钠咸压ぶ需b定到3 059個(gè)蛋白，其中899個(gè)蛋白、110個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)、10個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)和20個(gè)乙?；揎椢稽c(diǎn)在侵染前后有顯著變化。

5 展望

隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，對(duì)基因功能的詮釋成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的主要內(nèi)容。定量蛋白質(zhì)組學(xué)在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，定量蛋白質(zhì)組學(xué)通過(guò)研究與某個(gè)功能有關(guān)的一群蛋白表達(dá)差異，建立細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，揭示生命奧秘。iTRAQ技術(shù)以其諸多優(yōu)點(diǎn)，在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行的細(xì)胞死亡調(diào)控機(jī)理研究，期望采用iTRAQ技術(shù)分析調(diào)控細(xì)胞壞死的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，并從中發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)和化療敏感性標(biāo)志物。而這一技術(shù)本身的不斷進(jìn)步使其能更有效地分析生物樣本，回答各種生物學(xué)問(wèn)題。將來(lái)iTRAQ技術(shù)會(huì)更廣泛地應(yīng)用到生物學(xué)研究中，并極大地推動(dòng)生物學(xué)研究的發(fā)展。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

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Recent advance in high accuracy iTRAQ for quantitative proteomics

Shouzhi Ma1, Yulin Sun1, Xiaohang Zhao1, and Ping Xu2,3
1 State Key Laboratory of Molecular O ncology, Cancer Hospital & Institute, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China 2 Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China 3 Beijing Proteome Research Center, Beijing 102206, China

Nowadays, proteomics focuses on quantitative analysis rather than qualitative. In the field of quantitative proteomics, Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) is one of the most widely used techniques. The advantage of iTRAQ is high throughput, high stability and free of the restriction of sample property. iTRAQ is suitable for almost all kinds of samples, and up to 8 samples can be analyzed simultaneously by commercially available kit. Along with the development of techniques, more and more mass spectrometry (MS) platforms are used in iTRAQ experiments and the accuracy of iTRAQ has been improved. iTRAQ has been applied to studies of microorganism, animal, plant, medical and protein post-translational modification. Here we review the recent progress in the development of iTRAQ and its applications in quantitative proteomics.

quantitative proteomics, isobaric tags for relative and absolute quantitation, accuracy

December 18, 2013; Accepted: January 27, 2014

Ping Xu. Tel: +86-10-83147777-1314; E-mail: xupingghy@gmail.com Xiaohang Zhao. Tel: +86-10-67709015; Fax: +86-10-87778360; E-mail: zhaoxh@cicams.ac.cn

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2012AA020206), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31070673, 31170780, 91029725, 81071789), Beijing Natural Science Foundation (No. 5112012).

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2012AA020206)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31070673, 31170780, 91029725, 81071789)，

北京市自然科學(xué)基金 (No. 5112012) 資助。