Snail和Raf激酶抑制蛋白與非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

齊 戰(zhàn) 楊大運 高少偉

Snail和Raf激酶抑制蛋白與非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

齊 戰(zhàn)1楊大運2△高少偉3

目的 檢測非小細胞肺癌（NSCLC）組織中Snail和Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的表達情況。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測124例NSCLC及67例癌旁正常肺組織中Snail和RKIP的表達情況，比較臨床病理特征與Snail和RKIP陽性表達率的關(guān)系，分析Snail和RKIP的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果Snail蛋白在肺癌中表達率為79.03%，高于正常肺組織的19.40%（χ2=63.538，P＜0.01）；RKIP在肺癌中的表達率為36.29%，低于正常肺組織的77.61%（χ2=29.716，P＜0.01）。兩者的表達水平均與肺癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后生存時間有關(guān)；Snail與RKIP的蛋白表達水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論Snail高表達與RKIP低表達可能是NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)標(biāo)志，可作為NSCLC的預(yù)后指標(biāo)。

癌,非小細胞肺；raf激酶類；腫瘤侵潤；腫瘤轉(zhuǎn)移；非小細胞肺癌；Snail;Raf激酶抑制蛋白

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一，全世界每年有100多萬人死于肺癌，其中80%為非小細胞肺癌（NSCLC）患者。由于肺癌的早期臨床癥狀不明顯，患者就診時大部分處于進展期，預(yù)后很差，5年生存率僅為15.6%[1]，局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，研究調(diào)控惡性腫瘤細胞發(fā)生EMT過程的分子機制，探索發(fā)生EMT的關(guān)鍵分子與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系是當(dāng)前面臨的主要問題。Snail和Raf激酶抑制蛋白（RKIP)與EMT的發(fā)生有關(guān)，本研究通過檢測肺癌組織及癌旁肺組織中Snail蛋白和RKIP蛋白的表達情況，探討兩者與NSCLC臨床病理因素以及患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料 選擇我院2010年7月—2011年7月確診為NSCLC的癌組織標(biāo)本124例，其中男98例，女26例。年齡31～78歲，中位年齡60歲。病理類型：鱗癌86例，腺癌38例。分化程度：高分化癌45例，中分化癌38例，低分化癌41例。肺癌分期采用2009年IASLC/UICC公布的第七版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期38例（Ⅰa18例，Ⅰb20例）,Ⅱ期30例（Ⅱa 14例，Ⅱb16例)，Ⅲ期56例（Ⅲa43例，Ⅲb13例）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移72例。所有病例術(shù)前均未接受放療或化療。取癌旁正常肺組織67例為對照。即用型兔抗人Snail多克隆抗體、兔抗人RKIP多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒（福州邁新公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法 標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4μm切片，采用常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶法（S-P法）檢測Snail和RKIP表達情況。首先3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，高溫高壓修復(fù)抗原，然后依次滴加一抗，生物素標(biāo)記的二抗和S-P酶，DAB顯色3～5 min，蘇木精復(fù)染，常規(guī)封片。同時以福州邁新公司提供的陽性標(biāo)本切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 Snail和RKIP以細胞質(zhì)或（和）細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，取任意10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，進行如下評分。（1）細胞染色強度評分：基本不著色者0分，著色淡者1分；著色適中者2分，著色深者3分。（2）陽性細胞占計數(shù)細胞的比例評分：＜5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，＞75%記4分。?。?）、（2）兩項評分乘積作為總積分：0分為陰性；≥1分為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料用例（%）表示，比較采用χ2檢驗。采用Spearman法進行等級相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail和RKIP在癌旁正常肺組織中及肺癌組織中的表達 在癌旁正常肺組織中，Snail蛋白表達呈陰性或弱陽性；在肺癌組織中，Snail蛋白表達呈中等強度陽性或強陽性，見圖1～2，但RKIP在癌旁正常肺組織中高表達，在肺癌組織中低表達，見圖3～4。Snail蛋白在癌旁正常肺組織的陽性表達率低于肺癌組織，RKIP在癌旁正常肺組織的陽性表達率高于肺癌組織（P＜0.05），見表1。

2.2 Snail與RKIP表達與臨床病理特征的關(guān)系 在肺癌組織中，Snail蛋白與RKIP的陽性表達均與性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑大小及病理類型無關(guān)（P＞0.05）。肺癌的分化程度越低、TNM分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的Snail蛋白表達率較高，術(shù)后生存期＜2年患者的Snail蛋白表達率高于生存期≥2年者（均P＜0.05）；肺癌的分化程度越低、TNM分期越高患者的RKIP表達率較低，術(shù)后生存期＜2年患者的RKIP表達率低于生存期≥2年者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者RKIP表達率低于無轉(zhuǎn)移者（均P＜0.05），見表2。

2.3 Snail蛋白與RKIP表達的關(guān)系 Snail蛋白與RKIP在NSCLC組織中的表達呈負(fù)相關(guān)，見表3。

Table1 Expression of Snail and RKIP in lung cancer tissues and normal lung tissues表1 肺癌、正常肺組織中Snail蛋白與RKIP表達結(jié)果 例（%）

Table 2 Relationship between expressions of Snail and RKIP with clinicopathologic characteristics of lung cancer表2 肺癌組織中Snail蛋白和RKIP陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

Table 3 Relationship of Snail and RKIP expression in lung cancer表3 肺癌中Snail蛋白與RKIP表達的相關(guān)性

3 討論

Snail是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在細胞內(nèi)起負(fù)向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，它通過抑制上皮鈣黏素E的轉(zhuǎn)錄，使細胞間黏附力減弱，細胞彼此分離并獲得活動能力，腫瘤細胞易于從原發(fā)灶脫落，進而發(fā)生腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，Snail在非小細胞肺癌[2]、膀胱癌[3]、乳腺癌[4]等多種腫瘤組織中表達上調(diào)。

本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中的Snail蛋白陽性表達率為79.03%，明顯高于正常肺組織的19.40%。且肺癌的分化程度越高，Snail蛋白的陽性表達率越低，隨著臨床分期的進展、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，Snail蛋白的表達率增高，且生存時間＜2年者的Snail蛋白表達陽性率高于≥2年者，提示Snail蛋白表達上調(diào)與肺癌組織的惡性程度有關(guān)。研究顯示，Snail蛋白的陽性表達率與不同病理類型有關(guān)，腺癌的陽性表達率高于鱗癌[5]。但本研究并未發(fā)現(xiàn)Snail蛋白的陽性表達率與病理類型有關(guān)，以上不同可能與研究樣本量小有關(guān)。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多階段、多步驟、多因素參與的復(fù)雜病理過程，通過腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的上調(diào)或下調(diào)對整個過程進行調(diào)控。因此，針對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，阻斷其信號傳導(dǎo)通路將成為治療腫瘤的新策略。RKIP是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，參與調(diào)節(jié)ERK、G蛋白、核因子（NF）-κB等多條信號傳導(dǎo)通路，具有抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的功能。RKIP在結(jié)直腸癌[6]、膀胱癌[7]、胃癌[8]等多種腫瘤組織中表達下調(diào)，其表達水平與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)。本研究顯示，在癌旁正常肺組織中，RKIP在肺泡上皮細胞呈陽性表達，陽性表達率為77.61%，高于在NSCLC中的36.29%。肺癌的分化程度越低，RKIP的表達水平越低，隨著臨床分期的增加、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，RKIP的表達水平降低，且生存時間＜2年者的RKIP表達水平低于≥2年者，表明RKIP表達下調(diào)與肺癌組織的惡性程度及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Snail可直接作用于靶基因上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，促進EMT的發(fā)生及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[3]。RKIP可通過NF-κB/Snail途徑或直接影響E-cadherin的表達，進而抑制EMT的進展，從而發(fā)揮其抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的功能。研究還發(fā)現(xiàn)，Snail/RKIP比例失衡不僅與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，而且與瘤細胞對化療藥物的耐藥性有關(guān)[9-11]。本研究顯示，Snail和RKIP在NSCLC組織中的表達呈負(fù)相關(guān)，提示兩種蛋白在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著不同的作用，有待于進一步探討研究。

正常組織中癌基因和抑癌基因之間存在著微妙的平衡關(guān)系，維持著上皮-間質(zhì)的穩(wěn)定。當(dāng)NF-κB/ Snail/RKIP環(huán)路破壞，Snail表達上調(diào)，RKIP的表達程度不足以抑制Snail的活性，環(huán)路之間的平衡被打破，導(dǎo)致了EMT發(fā)生及腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，因此，EMT過程是Snail和RKIP表達不平衡的結(jié)果。通過siRNA靶向干擾Snail或轉(zhuǎn)染RKIP基因，將為腫瘤的靶向治療提供一個新思路。

Figure 1 Positive expression of Snail in lung cancer tissue（SP,×200）圖1 Snail在肺癌組織陽性表達免疫組化染色圖（SP法,×200）

Figure 2 Negative expression of Snail in lung cancer tissue（SP,×200）圖2 Snail在肺癌組織陰性表達免疫組化染色圖（SP法,×200）

Figure 3 Positive expression of RKIP in normal lung tissue（SP,×200）圖3 RKIP在正常肺組織陽性表達免疫組化染色圖（SP法，×200）

Figure 4 Negative expression of RKIP in lung cancer tissue（SP,×200）圖4 RKIP在肺癌組織陰性表達免疫組化染色圖（SP法，×200）

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（2013-12-18收稿 2014-02-02修回）

（本文編輯 閆娟）

Correlations of Snail and RKIP expressions with Tumor Invasion and Metastasis in Non-Small Cell Lung Cancer

QI Zhan1，YANG Dayun2,GAO Shaowei3
1 Department of Thoracic Surgery，2 Department of Internal Medicine，the Fourth Hospital of Hebei Medical Univercity, Shijia zhuang 050011,China;3 Department of Surgery,Zhao Country Hospital

ObjectiveTo detect Snail and Raf kinase inhibitor protein(RKIP)expressions in NSCLC(Non-Small Cell Lung Cancer)and their relationship with the pathological characteristics of tumor.MethodsImmunohistochemistry was used to detect Snail and RKIP expression in 124 NSCLC samples and 67 paraneoplastic normal lung tissue samples. Snail and RKIP positive expression rates were compared upon clinicopathologic characteristics.Correlation of Snail expression with RKIP expression was also analyzed.ResultsPositive expression rate of Snail was 79.03%in lung cancer,which is higher than that in normal lung tissue 19.40%(χ2=63.538,P＜0.01);positive expression rate of RKIP was 36.29%in lung cancer which is lower than that in normal lung tissue 77.61%(χ2=29.716，P＜0.01),Snail and RKIP expressions are correlated with tumor differentiation,TNM stage,lymph node metastasis and postoperative survival time(P＜0.05,respectively). Snail protein expression is negatively correlated with RKIP expression in NSCLC(P＜0.05).ConclusionHigh Snail expression and the low RKIP expression might be important biological markers for invasion and metastasis of NSCLC,which might be used as important prognostic indicators in NSCLC.

carcinoma,non-small-cell lung；raf kinases；neoplasm invasiveness；neoplasm metastasis；NSCLC；snail;Raf kinase inhibitor protein

R734.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.021

*河北省科技支撐計劃項目（項目編號：12277723）

1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科（郵編050011），2內(nèi)科；3趙縣人民醫(yī)院外科

△通訊作者 E-mail:ssyydy@sina.com