長春地區(qū)豬源大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性分析

王基偉，孫洋，紀雪，劉軍，祝令偉，周偉，佟盼盼，郭學軍，李曉慧，馮書章?

長春地區(qū)豬源大腸桿菌的分離鑒定和耐藥性分析

王基偉1，2，孫洋2，3，紀雪2，3，劉軍2，3，祝令偉2，3，周偉2，3，佟盼盼2，3，郭學軍2，3，李曉慧3，4，馮書章2，3?

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長春130118；2.軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122；3.吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春130062；4.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院，長春130062）

為了解吉林省長春地區(qū)豬源大腸桿菌的耐藥情況，于2013年采集318份豬源樣品，分離鑒定大腸桿菌275株。以氨芐西林、頭孢噻肟等15種藥物進行了藥物敏感性實驗，多重PCR方法進行系統(tǒng)進化分群。結果表明，大腸桿菌分離株對四環(huán)素、氨芐西林和磺胺甲基異惡唑耐藥最嚴重（83.63%、52.72%、51.27%），全部菌株對美洛培南、多粘菌素敏感，其中176株菌表現(xiàn)為對3類以上抗生素的多重耐藥（64.00%）。從仔豬腹瀉樣品分離大腸桿菌對β－內(nèi)酰胺類抗生素、喹諾酮類抗生素、四環(huán)素、氯霉素及磺胺甲基異惡唑的耐藥率顯著高于健康豬和豬肉樣品分離株的耐藥率。大腸桿菌分離株主要為A群和B1群。研究獲得了吉林長春地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性的基本流行病學數(shù)據(jù)，為指導養(yǎng)殖業(yè)的臨床用藥及耐藥性監(jiān)測提供了依據(jù)。

豬；大腸桿菌；耐藥性

大腸桿菌是人和動物腸道共生菌群的組成部分，部分致病性大腸桿菌能引起尿道感染等多種傳染?。?］。大腸桿菌可能作為耐藥基因的儲存庫，將耐藥性基因傳播至其他腸桿菌科細菌或其他烈性病原菌。我國一些豬場為了預防疾病發(fā)生盲目用藥、過量用藥，濫用抗生素的現(xiàn)象屢見不鮮［2］，細菌耐藥性呈現(xiàn)耐藥率不斷上升，耐藥譜廣，多重耐藥，耐藥傳播加速等趨勢。從生豬飼養(yǎng)、屠宰到豬肉的消費，耐藥菌可能通過這一鏈條傳播給人類，產(chǎn)生嚴重的公共衛(wèi)生問題。本研究對吉林省長春地區(qū)豬源樣品進行了大腸桿菌的分離鑒定及耐藥譜分析，以期為合理使用抗生素和耐藥性監(jiān)測提供依據(jù)，并為進一步研究耐藥性的傳播機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品來源 2013年從長春地區(qū)采集生豬肛門拭子樣品191份、豬肉樣品96份（屠宰場及農(nóng)貿(mào)市場）和仔豬腹瀉樣品31份。

1.2 試劑及培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂購自青島高科園海博生物技術有限公司；大腸桿菌顯色培養(yǎng)基購自法國科瑪嘉公司；MH瓊脂購自法國梅里埃公司；氯霉素、四環(huán)素、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松、美洛培南、慶大霉素、磺胺甲基異惡唑、阿米卡星、多黏菌素B、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星藥敏片，購自Oxoid公司；PCR試劑、DNA Marker DL2000，購自日本TaKaRa公司；大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC25922由本實驗室保存。引物由invitrogen公司合成（表1）。

1.3 豬源大腸桿菌分離鑒定

1.3.1 大腸桿菌分離培養(yǎng) 將豬肛拭子樣品及仔豬腹瀉糞便拭子樣品加入2 mL 0.85%生理鹽水，室溫振蕩混勻10 min，靜置3 min；豬肉樣品以無菌棉簽擦拭豬肉表面，樣品于無菌生理鹽水振蕩懸?。幻繕悠贩謩e吸取10 μL上清于科瑪嘉培養(yǎng)基平板劃線，37℃培養(yǎng)16 h，挑取紫紅色典型菌落在麥康凱培養(yǎng)基二次劃線純化。

1.3.2 大腸桿菌PCR鑒定 于麥康凱培養(yǎng)基挑取符合大腸桿菌形態(tài)特定的單菌落，接種LB肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16 h，制備PCR模板，以大腸桿菌16S rDNA特異性引物做PCR鑒定［3］。

1.4 藥敏實驗 實驗選取15種具有代表性的抗菌藥物，包括β－內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等7大類。依據(jù)CLSI推薦方法［4］，采用Kirby－Bauer紙片擴散法，根據(jù)抑菌圈大小判斷耐藥（R）、中介（I）和敏感（S），大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株，多粘菌素的耐藥判斷按照丹麥細菌耐藥監(jiān)測系統(tǒng)（DAN－MAP）所使用的標準［5］。

1.5 細菌的進化分群 采用多重PCR方法對大腸桿菌進行分群，將大腸桿菌分成A、B1、B2、D共四個群，實驗方法參照文獻［6］。

表1 試驗所用PCR引物

2 結果與分析

2.1 細菌分離鑒定 從318份樣品中分離275株非克隆株大腸桿菌，經(jīng)大腸桿菌16S rDNA特異性引物PCR鑒定，均為大腸桿菌。

2.2 大腸桿菌系統(tǒng)進化分群 275株豬大腸桿菌系統(tǒng)進化分群多重PCR結果統(tǒng)計A群：201株；B1群：33株；B2群：13株；D群：28株。結果顯示屬A群的分離株較多，B1、D、B2群數(shù)量依次降低，一般認為B2和D群多屬致病性的大腸桿菌，這兩群大腸桿菌占總分離數(shù)的14.90%。從表2可以看出，腹瀉仔豬大腸桿菌分離株B2和D群的比例高于健康豬大腸桿菌。

表2 豬源大腸桿菌分離株分群結果表

2.3 藥敏實驗結果 大腸桿菌分離株對臨床治療和預防常用藥物如四環(huán)素、磺胺甲基異惡唑、氨芐西林、氯霉素和阿米卡星，耐藥率分別為83.63%，51.27%，52.72%，39.27%，28.00%。對第三代頭孢菌素耐藥率較低，頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟耐藥率分別為3.27%，4.36%，5.45%。對亞胺培南，阿莫西林／克拉維酸和第三代頭孢菌素耐藥率最低。對美洛培南和多粘菌素均敏感。統(tǒng)計結果表明，從仔豬腹瀉樣品分離大腸桿菌對氨芐西林（90.32%）、慶大霉素（48.38%）、左氧氟沙星（58.06%）、環(huán)丙沙星（67.74%）、磺胺甲基異惡唑（70.96%）、氯霉素（54.83%）的耐藥率顯著高于健康豬肛試子和豬肉樣品分離株的耐藥率（表3、表4）。

表3 豬源大腸桿菌對抗菌藥物的敏感性結果

表4 豬源大腸桿菌藥物敏感性與分群的相關性

2.4 耐藥譜分析 結果如表5所示，僅有11株分離株對15種藥物全部敏感（4.00%），有61株菌只對一種抗生素耐藥，其余203株大腸桿菌表現(xiàn)為對2種以上抗菌藥物耐藥。1～3種抗生素耐藥菌株有134株（48.72%）；4～6種抗生素耐藥菌株有92株（33.45%）；7～9種抗生素耐藥菌株有33株（12.00%）；10～12種抗生素耐藥菌株有5株（1.81%）。

表5 275株豬大腸桿菌的耐藥模式

實驗的15種抗生素可歸為四環(huán)素類、氨基糖苷類、β－內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、磺胺類、氯霉素類和多肽類抗菌藥物。多重耐藥表型一般定義為同時對≥3類抗生素耐藥，統(tǒng)計結果表明（圖1），多重耐藥菌數(shù)達176株（64.00%），多耐藥菌株耐6類抗生素的比例最大，占25.66%，所耐抗生素的種類是β－內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類、氯霉素類和磺胺類藥物。

3 討論與小結

本研究對長春地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥情況進行初步調(diào)查，實驗選取具有代表性15種抗菌藥物進行藥物敏感試驗。在選擇的15種抗菌藥物中，四環(huán)素對大部分大腸桿菌分離株已基本失去作用（83.63%），這由于四環(huán)素類抗生素價格低廉，抗菌譜廣，養(yǎng)殖戶長期大量使用這些藥物進行預防和治療，造成了對此類藥物的廣泛耐藥，與藥敏檢測結果相符。但對頭孢他啶，頭孢噻肟，頭孢曲松，亞胺培南，美洛培南，多粘菌素均較敏感。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這幾種藥物成本較高，養(yǎng)殖戶很少使用。與國內(nèi)不同地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性研究結果比較，發(fā)現(xiàn)長春地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥率較其他地區(qū)普遍偏低，2010年河南地區(qū)規(guī)模化豬場病料樣品分離大腸桿菌對四環(huán)素，慶大霉素，環(huán)丙沙星，氯霉素的耐藥率分別為94.80%，63.80%，72.40%，63.80%［7］。本實驗從腹瀉樣品分離大腸桿菌對四環(huán)素，慶大霉素，環(huán)丙沙星，氯霉素的耐藥率分別為87.09%，48.38%，67.74%，54.83%。2009年廣東屠豬肉樣品分離大腸桿菌對四環(huán)素，慶大霉素，氨芐西林，氯霉素的耐藥率分別為88.39%，33.93%，77.68%，67.85%。本實驗從豬肉樣品分離大腸桿菌對四環(huán)素，慶大霉素，氨芐西林，氯霉素的耐藥率分別為69.09%，20.00%，45.45%，30.90%［8］。產(chǎn)生此種現(xiàn)象原因可能是不同地區(qū)養(yǎng)殖模式和預防觀念的不同，南方多大規(guī)模養(yǎng)殖，預防為先，治療為輔。北方散養(yǎng)戶居多，治療為先，預防為輔。為了提高飼料轉化率，促進畜禽生長，規(guī)?；B(yǎng)殖在飼料中添加大量抗生素，對耐藥性菌株進行人工選擇。所以大規(guī)模養(yǎng)殖地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥率更高，長春地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥率相對較低，但耐藥情況仍很嚴重，不容忽視。

研究結果表明，豬源大腸桿菌B2和D群分離株對氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素的耐藥率分別為60.00%，10.00%，10.00%，10.00%，45.00%，92.50%。豬源大腸桿菌腸道B1和A群分離株對氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素的耐藥率分別為51.48%，3.40%，3.82%，1.27%，35.31%，82.12%。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，豬源大腸桿菌B2和D群分離株對氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素的耐藥率均高于豬源大腸桿菌腸道B1和A群分離株的耐藥率（表4）。本實驗仔豬腹瀉樣品分離株耐藥情況較其他樣品分離株嚴重，經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖戶對于腹瀉仔豬的治療，幾乎不進行任何藥敏試驗，盲目用藥和過量用藥情況十分嚴重，可能引起了仔豬腹瀉樣品分離株耐藥情況更嚴重。

伴隨著養(yǎng)豬業(yè)蓬勃發(fā)展，抗生素的使用量也空前增長，據(jù)統(tǒng)計我國每年抗生素原料生產(chǎn)量約為21萬噸，其中有46.10%用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)［9］。根據(jù)美國疾病預防控制中心的資料，美國使用的抗生素促生長劑包括17大類，幾乎包括了治療人類感染的全部抗生素種類［10］。我國是養(yǎng)豬大國，豬肉是人們?nèi)粘ＯM食品，豬肉食品安全問題越來越受到人們的關注。因養(yǎng)豬業(yè)中大量使用抗生素，使得在養(yǎng)殖環(huán)境中，形成細菌耐藥基因貯存庫，耐藥性細菌可通過生豬—豬肉—人的鏈條傳播給人類。這些細菌能以人類和動物相重疊的共生菌為載體，轉移抗生素耐藥性基因［11］，對人類健康造成巨大威脅。我國吉林長春地區(qū)豬源大腸桿菌呈現(xiàn)耐藥譜廣、耐藥率高、多重耐藥情況嚴重的特點，相關部門應高度重視，制定相應的監(jiān)測機制和養(yǎng)殖業(yè)抗生素的使用規(guī)范。

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（編輯：侯向輝）

Antimicrobial Resistance of Escherichia coli Isolated from Swine in Changchun

WANG Ji－wei1，2，SUN Yang2，3，JI Xue2，3，LIU Jun2，3，ZHU Ling－wei2，3，ZHOU Wei2，3，TONG Pan－pan2，3，GUO Xue－jun2，3，LI Xiao－h(huán)ui3，4，F(xiàn)ENG Shu－zhang2，3?
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Institute of Veterinary Science，The Academy of Military Medical Sciences，Changchun 130122，China；3.Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prerention and Contral，Changchun 130062，China；4.Veterinary Institute in Jilin Province，Changchun 130062，China）

In order to investigate the antimicrobial resistant of Escherichia coli from swine，a total of 275 Escherichia coli were recovered from 318 swine origin samples in Chuangchun in Jilin province，The phylogenetic background determinated by multiplex PCR.Susceptibility of 275 isolates to fifteen antimicrobial agents were tested.Among swine E.coli isolates，83.63%were resistant to tetracycline，52.72%to ampicillin and 51.27%to sulfamethoxazole.Most of the isolates（176）were multiple resistant bacteria strains；it meant that 64%of the E.coli strains were resistant to more than 3 kinds of antimicrobial agents.All of the isolates were sensitive to meropenem and polymyxin B.In addition，the drug－resistant rates to quinolones，tetracycline，chloramphenicol，sulfanilamide，and β－lactam antibiotics of the E.coli isolates from diarrhea piglets are remarkbly higher thanthose isolates from healthy swine and pork.The majority of isolates belonged to phylogenetic group A and B1.In this study，epidemiological background and basic data of drug resistance of E.coli from swine in Chuangchun in Jilin province.It could give some directions to clinical medication and drug resistance surveillance.

swine；Escherichia coli；drug resistance

2014－08－12

A

1002－1280（2014）11－0014－05

S852.61

國家科技重大專項（No.2013ZX10004－217－002）；863項目（2012AA022006）；廣州市科技計劃項目（No.201300000036）

王基偉，碩士研究生，從事預防獸醫(yī)學研究。

馮書章。E－mail：fengsz＠hotmail.com