產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)特性及5 L罐發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究＊

梁澤鑫，王菊芳

(1.廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510080;2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

丙酸作為一種精細(xì)化工產(chǎn)品和有機(jī)合成材料，被廣泛用作食品、谷物、飼料的防腐劑［1-2］，相比于苯甲酸，山梨酸，因?yàn)槠浒踩?、?jīng)濟(jì)性受到了人們的普遍歡迎，并且丙酸及其鹽被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為GRAS(Generally recognized as safe即一般認(rèn)為安全)［3］;其衍生物在制藥、塑料、香料、除草劑等行業(yè)中也有廣泛的應(yīng)用［1-3］。

美國(guó)和德國(guó)是丙酸生產(chǎn)大國(guó)，其產(chǎn)量約占全球丙酸總產(chǎn)量的90%以上，這些基本上采用化學(xué)合成的方法來生產(chǎn)，2006年全球丙酸需求量為349000噸，2006-2010這五年間，丙酸全球年消費(fèi)增長(zhǎng)率大約為2.5%［4］;在我國(guó)，丙酸年產(chǎn)量?jī)H為1000多噸，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)騰飛，飼料，食品，醫(yī)藥，農(nóng)藥等行業(yè)也飛速發(fā)展，對(duì)丙酸的需求量越來越大，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)丙酸進(jìn)口量從1996年6700噸增加到 2004年的1.6萬噸［5］。

目前丙酸的生產(chǎn)主要采用化工合成的方法，但隨著石油資源的日益匱乏及人們對(duì)環(huán)境保護(hù)的重視，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸作為一種替代途徑越來越受人們的青睞［6］。相比石油化工法，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸具有以下優(yōu)勢(shì)，首先，化學(xué)合成法生產(chǎn)丙酸的所需原料丙烷，丙醛等的價(jià)格易受當(dāng)今石油產(chǎn)量和價(jià)格的波動(dòng)而波動(dòng)，原料供應(yīng)不暢容易造成丙酸市場(chǎng)的不穩(wěn)定;其次，通過發(fā)酵法制得的丙酸用作食品防腐劑，其安全性更易被人們接受認(rèn)可;第三，現(xiàn)在丙酸菌已經(jīng)被人們廣泛應(yīng)用于乳酪工業(yè)，不存在安全性隱患;第四，相比石油化工的高污染、高能耗，發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸過程溫和，環(huán)境友好性強(qiáng)，符合當(dāng)今可持續(xù)發(fā)展和低碳工藝的理念。

產(chǎn)酸丙酸桿菌被認(rèn)為是微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的最理想菌株［7］，本實(shí)驗(yàn)室保存有美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)楊尚天教授贈(zèng)送的一株產(chǎn)酸丙酸桿菌，本文從該菌的基本生長(zhǎng)特性、底物利用情況、產(chǎn)物抑制等方面出發(fā)，研究該菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸的情況，并對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最后在5L發(fā)酵罐水平研究該菌發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)丙酸的動(dòng)力學(xué)，初步了解該菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸的能力。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

菌種Propionibacterium acidipropionici ATCC 4875為美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)楊尚天實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)培養(yǎng)基成分:葡萄糖5-60 g/L，酵母抽提物10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，K2PO40.25 g/L，MnSO40.05 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

賽多利斯科學(xué)儀器公司生產(chǎn)的PB-10酸度計(jì)，Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的Genesys 10 vis分光光度計(jì)，廣州柯橋有限公司生產(chǎn)的恒溫振蕩器，上海海太光電生物科技有限公司生產(chǎn)的厭氧罐和自動(dòng)厭氧抽排系統(tǒng)，德國(guó)貝朗公司生產(chǎn)的5LBraun型發(fā)酵罐，Waters公司生產(chǎn)的Waters2695高效液相色譜儀，Milford公司生產(chǎn)的RI-2414視差折光檢測(cè)器，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的Aminex HPX-87H型有機(jī)酸柱。

1.3 菌體生長(zhǎng)特性研究

在搖瓶水平對(duì)該菌的生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，所用搖瓶規(guī)格為100 mL血清瓶，以膠塞密封，充高純氮?dú)獗ＷC產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)所需的厭氧環(huán)境。研究?jī)?nèi)容包括菌體生長(zhǎng)曲線及初始pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、種齡對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響，探討該菌可以利用的碳源譜、氮源譜范圍，不同初始葡萄糖濃度對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響，為了解丙酸鹽對(duì)菌體的產(chǎn)物抑制情況，對(duì)不同初始濃度的丙酸鹽(丙酸鈉和丙酸鈣)進(jìn)行了研究。

1.4 5 L罐發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

以1.3中確定的丙酸菌最適生長(zhǎng)條件，往5 L發(fā)酵罐中通入高純氮?dú)獗ＷC發(fā)酵過程中的厭氧環(huán)境，研究產(chǎn)酸丙酸桿菌利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的動(dòng)力學(xué)。

1.5 測(cè)定方法

1.5.1 生長(zhǎng)量測(cè)定 取不同時(shí)間的發(fā)酵液，用Genesys 10 Vis分光光度計(jì)在600 nm處測(cè)定吸光值。通過吸光值與對(duì)應(yīng)細(xì)胞干重的校正曲線得出，1個(gè)吸光度值對(duì)應(yīng)約0.362 g/L的細(xì)胞干重。

1.5.2 殘?zhí)羌鞍l(fā)酵產(chǎn)物的檢測(cè) 使用Waters2695液相色譜儀，檢測(cè)器為Milford RI-2414型視差折光檢測(cè)器，色譜柱為Aminex HPX-87H柱，柱溫為60℃，以25 mmol/L的H2SO4為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

以5%的接種量接種至50 mL培養(yǎng)基中，混勻后使用無菌注射器抽取8 mL于15 mL西林瓶中，放置于32℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h，每隔4 h測(cè)定一次菌液OD600，得到 P.acidipropionici的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果，如圖1所示，從圖中的生長(zhǎng)曲線可以看出，延遲期大約為10 h，50 h后即進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，菌體生長(zhǎng)最大OD600為7.5左右。

圖1 產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of P.acidipropionici

2.2 溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速、種齡及接種量對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響

在5 g/L葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中，研究溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速、種齡、接種量對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌的影響，結(jié)果如下圖2所示:

溫度和初始pH作為發(fā)酵的重要影響因素［8-9］，菌體及體內(nèi)各種酶均隨溫度和pH的變化而受到影響。由圖2(A)和(B)可知，產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸最適溫度為32℃，最適pH為7.0，此時(shí)菌體干重及丙酸產(chǎn)量均達(dá)到最大值，菌體干重分別為2.10 g/L和2.28 g/L，丙酸濃度分別為2.10 g/L 和 2.71 g/L。因種子液中產(chǎn)物有酸，pH呈酸性，接種后會(huì)造成培養(yǎng)基初始pH的下降，故在發(fā)酵罐水平控制pH在6.5左右。由圖2(C)知，搖床轉(zhuǎn)速控制在150 r/min時(shí)，產(chǎn)酸丙酸桿菌菌體及產(chǎn)酸均達(dá)到最大值，分別為1.84 g/L 和1.97 g/L。由圖2(D)看出，接種24 h種齡丙酸菌，發(fā)酵液中菌體及丙酸產(chǎn)量達(dá)最大值，分別為 1.98 g/L 和 1.95 g/L。由圖 2(E)得出，1%、3%的接種量下，菌體生長(zhǎng)延遲期較長(zhǎng)，在8%、10%的高接種量下，菌體達(dá)到穩(wěn)定期后，容易衰亡，因此確定5%是最佳接種量值，此時(shí)，菌體及丙酸產(chǎn)量分別為1.82 g/L 和 1.98 g/L(圖2 F 所示)。

2.3 碳源、氮源發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

不同微生物菌種具有不同的碳源譜和氮源譜，在5 g/L碳源濃度下，培養(yǎng)36 h，測(cè)得菌體產(chǎn)量，結(jié)果如圖3(A)所示;在 1.4 g/L氮元素濃度下，培養(yǎng)36 h，測(cè)得菌體產(chǎn)量，結(jié)果如圖3(B)所示:

由圖3(A)得出，產(chǎn)酸丙酸桿菌能夠利用的底物范圍很廣，多數(shù)單糖(戊碳糖和六碳糖)和雙糖均可被產(chǎn)酸丙酸桿菌利用，需要指出的是，乳酸鹽和甘油作為兩種特殊的碳源，也可以被該菌利用。近年來，生物柴油作為一項(xiàng)研究熱點(diǎn)，在其生產(chǎn)過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的甘油副產(chǎn)物［10-11］，這一廉價(jià)的副產(chǎn)物原料對(duì)于產(chǎn)酸丙酸桿菌而言是一很有前景的廉價(jià)碳源。由圖3(B)得出，該菌不能利用無機(jī)氮源，而酵母抽提物和胰蛋白胨兩種氮源混合使用，對(duì)該菌生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，與單獨(dú)以等量的酵母抽提物或胰蛋白胨為氮源，菌體產(chǎn)量要高出30.49%和282.14%(2.15 g/L vs.1.64 g/L 和 0.56 g/L)。

2.4 不同初始葡萄糖濃度對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響

通常高底物濃度會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制現(xiàn)象，在不同初始葡萄糖濃度培養(yǎng)基中，考察其對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酸的影響，結(jié)果如圖4、5所示:

由圖4得出，當(dāng)葡萄糖濃度由10 g/L到50 g/L范圍內(nèi)，丙酸菌生長(zhǎng)曲線沒有很大變化，沒有顯現(xiàn)出明顯的底物抑制現(xiàn)象，相反在低葡萄糖濃度下(5 g/L)，丙酸菌菌體產(chǎn)量較低，且在發(fā)酵末期，因?yàn)樘荚春谋M而出現(xiàn)菌體衰亡的現(xiàn)象。在100 g/L下，菌體生長(zhǎng)延遲期較長(zhǎng)，且菌體產(chǎn)量較低。此現(xiàn)象與所采用的實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)，因?yàn)槭窃诿芊獾难迤恐信囵B(yǎng)，培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，經(jīng)檢測(cè)100 g/L葡萄糖所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基的理化性質(zhì)發(fā)生了很大改變，培養(yǎng)基顏色加深，pH由7.0左右降低到5.45左右，由5.2中結(jié)論可知，pH是造成丙酸菌生長(zhǎng)緩慢的重要原因，因而還不能得出，高濃度的葡萄糖濃度(100 g/L)對(duì)丙酸菌生長(zhǎng)具有底物抑制現(xiàn)象。

由圖5可知，在搖瓶培養(yǎng)階段，因?yàn)楸岬膹?qiáng)產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，丙酸濃度達(dá)4.5 g/L左右，即不再消耗底物。在5 g/L葡萄糖濃度下，經(jīng)過36 h發(fā)酵，葡萄糖被耗盡，丙酸終濃度達(dá)2.1 g/L。在10 g/L葡萄糖濃度下，因?yàn)楸岬膹?qiáng)底物抑制，經(jīng)過80 h發(fā)酵后，殘?zhí)菨舛葹?1.8 g/L，發(fā)酵液中丙酸達(dá) 4.2 g/L，此時(shí)，細(xì)胞干重維持在一穩(wěn)定值3.7 g/L，丙酸濃度也不再上升。

2.5 不同初始丙酸鹽濃度對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)的影響

以10 g/L葡萄糖為碳源，考察不同丙酸鹽濃度對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如下圖所示:

圖2 溫度，初始pH，搖床轉(zhuǎn)速，種齡，接種量對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌的影響Fig.2 The compare of temperature，initial pH，speed of incubator，age of seed culture，initial cell concentration for P.acidipropionici;(A)Temperature;(B)Initial pH;(C)Speed of incubator;(D)Age of seed culture;(E)(F)Initial cell concentration

圖3 不同碳源和氮源對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Influence of different carbon and nitrogen sources on the growth of P.acidipropionici

圖4 不同濃度葡萄糖對(duì)丙酸生長(zhǎng)的影響Fig.4 Growth curve of P.acidipropionici effected by different glucose concentration

圖5 不同濃度葡萄糖對(duì)丙酸發(fā)酵的影響Fig.5 Propionic acid fermentation effected by different glucose concentration

由圖6可知，隨丙酸鹽濃度的增加，產(chǎn)酸丙酸桿菌菌體產(chǎn)量逐漸下降。初始丙酸鹽濃度在2 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)即受抑制，與對(duì)照相比菌體產(chǎn)量減少62.43%(2.988 g/L vs.7.953 g/L);當(dāng)初始丙酸鹽濃度為20 g/L時(shí)，丙酸菌基本不生長(zhǎng)。國(guó)外已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道過關(guān)于丙酸的強(qiáng)產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，并指出丙酸的強(qiáng)產(chǎn)物抑制是造成微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸濃度低，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低和產(chǎn)率低的重要原因［12］。

2.6 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)丙酸動(dòng)力學(xué)

在搖瓶培養(yǎng)階段，隨著菌體生長(zhǎng)，發(fā)酵液pH逐漸降低，在pH值小于4.5時(shí)，產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)極其緩慢，產(chǎn)物生成也相應(yīng)終止，為探討在調(diào)控pH的條件下，產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)量及產(chǎn)酸水平，按照搖瓶培養(yǎng)階段確定的最佳發(fā)酵條件，溫度32℃，pH 6.5，取培養(yǎng)24 h的種子液，以5%的接種量接種，在5 L罐水平上考察產(chǎn)酸丙酸桿菌生產(chǎn)丙酸的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，結(jié)果如圖7所示:

圖6 不同濃度丙酸鹽對(duì)丙酸菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Cell biomass of Propionibacterium acidipropionici effected by different propionate concentrations

圖7 游離產(chǎn)酸丙酸桿菌生產(chǎn)丙酸的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線 Fig.7 Kinetics of propionic acid production by free P.acidipropionici cells at pH 6.5 and 32 ℃

如圖7所示，經(jīng)過76 h的發(fā)酵，葡萄糖(初始濃度58.8 g/L)即被消耗完全。丙酸終濃度達(dá)22.4 g/L，丙酸得率和產(chǎn)率分別為0.381 g/g和0.295 g/L/h，同時(shí)有4.23 g/L的乙酸和4.44 g/L的琥珀酸產(chǎn)生，菌體產(chǎn)量達(dá)8.81 g/L，丙酸占總酸含量的72.10%。

國(guó)內(nèi)儀宏等人［13］，利用薛氏丙酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酸，批次發(fā)酵得丙酸終濃20.9 g/L，丙酸得率為0.40 g/g;馮小海等人［14］，利用費(fèi)氏丙酸桿菌，初始葡萄糖濃度為40 g/L，游離細(xì)胞發(fā)酵120 h后，丙酸終濃度達(dá) 12.58 g/L，丙酸產(chǎn)率僅為 0.12 g/L/h，采用FBB固定化發(fā)酵生產(chǎn)丙酸，經(jīng)補(bǔ)料發(fā)酵280 h，丙酸產(chǎn)量達(dá)45.91 g/L，為國(guó)內(nèi)有關(guān)丙酸產(chǎn)量報(bào)道的最高值。

3 結(jié)論和展望

(1)通過對(duì)產(chǎn)酸丙酸桿菌基本生長(zhǎng)特性的研究，確定其最適生長(zhǎng)溫度為32℃，最適初始pH值為6.5，最佳搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，最佳接種菌齡為24 h，最佳接種量為5%;

(2)通過對(duì)不同初始葡萄糖濃度的研究，得出在產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)過程中，無明顯底物抑制現(xiàn)象;

(3)產(chǎn)酸丙酸桿菌可利用碳源種類十分豐富，一般的單糖、雙糖均可利用，能夠以乳酸鹽和甘油為碳源，但不能利用淀粉等多糖，酵母抽提物和胰蛋白胨對(duì)該菌生長(zhǎng)具有協(xié)同促進(jìn)作用;

(3)丙酸鹽濃度高于2 g/L時(shí)，產(chǎn)酸丙酸桿菌生長(zhǎng)受明顯抑制;

(4)在5 L發(fā)酵罐中，初始葡萄糖濃度為58.8 g/L，經(jīng)72 h發(fā)酵，丙酸、乙酸、琥珀酸終濃度分別達(dá)22.4 g/L、4.23 g/L、4.44 g/L，丙酸得率和產(chǎn)率分別為 0.381 g/g和 0.295 g/L/h。

(5)與國(guó)內(nèi)同行相比，在游離細(xì)胞發(fā)酵中，產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酸具有一定優(yōu)勢(shì)，為提高丙酸發(fā)酵水平，可考慮采用固定化細(xì)胞發(fā)酵工藝來實(shí)現(xiàn)。

致謝!

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