復(fù)方參花搽劑的制備工藝及體外抑菌作用研究*

高 云 張典瑞 邵春月

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012； 2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

滲出性皮炎、濕疹及手足癬是臨床上常見(jiàn)的變態(tài)反應(yīng)性皮膚病，此類疾病病程較長(zhǎng)、容易反復(fù)，單純的西醫(yī)治療效果不甚滿意[1]，屬中醫(yī)辯證“濕熱”、“熱毒”類型的皮膚疾患，近年發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。

復(fù)方參花搽劑為我院自制制劑，主要有苦參、金銀花、黃柏、白鮮皮、蛇床子、白芷、地膚子、龍膽草等組成，有清熱燥濕、抗菌止癢之功效，臨床上可用于治療蕁麻疹、濕疹、滲出性皮炎、皮膚瘙癢癥、皮癬等多種皮膚病?？鄥A為處方中主要的有效成分之一，本研究采取正交試驗(yàn)法，以苦參堿的含量為指標(biāo)，優(yōu)化復(fù)方參花搽劑的制備工藝，同時(shí)采取K-B紙片擴(kuò)散法研究其體外抑菌作用，以期為制劑配制的規(guī)范化及臨床應(yīng)用的合理性提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器及試劑

高效液相色譜儀(日產(chǎn)島津LC20AT)，BP211D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，藥材(均購(gòu)自山東省藥材公司)，苦參堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110805-200508)，水為純化水，其余試劑均為分析純。

標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853各6株，山東省臨床檢驗(yàn)中心提供。試驗(yàn)菌株變形桿菌6株由本院臨床標(biāo)本分離，鑒定按照NCCLS文件方法進(jìn)行。游標(biāo)卡尺，規(guī)格(0-150 mm)×0.02 mm，安徽桐城量具廠生產(chǎn)。恒溫培養(yǎng)箱，規(guī)格GI6-2，美國(guó)SHELLAB。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參堿含量測(cè)定

精密稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相配成濃度為10 mg/ml的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0定容至10 ml。

以含量(X)對(duì)峰面積(Y)作回歸計(jì)算，其相關(guān)系數(shù)r=0.9997,得到回歸方程為Y=2.0007X-0.0007，表明在0.2 ～1 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

色譜條件：Econobase C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)色譜柱；柱溫：28℃；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(1∶99)；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。理論板數(shù)按苦參堿峰計(jì)不低于5000，主色譜峰與相鄰其它色譜峰的分離度不小于2。

精密度實(shí)驗(yàn)：對(duì)同一樣品溶液連續(xù)3次進(jìn)樣，以峰面積計(jì)算苦參堿的精密度，其RSD分別為2.06%、2.03%及1.94%，RSD均小于3%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)：從同一批提取方法平行取樣5份，制備得待測(cè)溶液，每樣品溶液進(jìn)樣3次，取平均值，所得結(jié)果RSD(%)為1.98%，表明重現(xiàn)性較好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：對(duì)同一樣品溶液每隔2 h進(jìn)樣，連續(xù)測(cè)定5次，以峰面積計(jì)算苦參堿的精密度，其RSD為1.18，結(jié)果表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

樣品測(cè)定：以苦參堿為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)不同提取方法所得樣品液進(jìn)行了測(cè)定。在上述HPLC條件下，樣品峰能達(dá)到很好分離，保留時(shí)間為15.6min左右。見(jiàn)圖1～3。

圖1 樣品HPLC圖

圖3 空白溶劑圖

2.2 提取工藝優(yōu)選

采用回流法，稱取處方中藥材共200 g，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以提取溶劑用量(A)、煎煮次數(shù)(B)、煎煮時(shí)間(C)三個(gè)因素為考察指標(biāo)，每個(gè)因素選取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，按照L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[3]，采用HPLC法測(cè)定提取液中苦參堿的含量，以有效成分含量高低為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 各因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

注：F1-0.01(2,4)= 18.0，F(xiàn)1-0.05(2,4)=6.94，F(xiàn)1-0.10(2,4)=4.32

從正交分析結(jié)果可以看出：3個(gè)因素對(duì)苦參堿含量的影響次序?yàn)锳 (加水倍量) > C(煎煮時(shí)間) > B (煎煮次數(shù))。其中加水倍量與苦參堿含量提取極顯著相關(guān)，9種方法平均提取率最高達(dá)52.92%，可以確定苦參堿最佳提取方法為A2B3C2，即加8倍量水、煎煮3次、每次煎煮1.5 h。

2.3 復(fù)方參花搽劑的制備

處方中8味藥加8倍量水，煎煮3次，每次1.5 h，過(guò)濾，合并3次濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.01～1.10、pH值為2.5～5.5的藥液，冷沉48 h，過(guò)濾，濾液灌裝成每瓶250 ml的成品，100℃流通蒸汽滅菌30 min備用。本品為紅褐色液體。

2.4 抑菌作用研究

將金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌分別用取菌環(huán)致密接種到普通培養(yǎng)基表面，以無(wú)菌操作將含復(fù)方參花搽劑藥液的濾紙片(直徑0.4 cm)貼到培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h觀察并測(cè)量環(huán)直徑。同法進(jìn)行空白對(duì)照試驗(yàn)。

由表4結(jié)果可見(jiàn)，復(fù)方參花搽劑對(duì)金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用。金黃色葡萄球菌對(duì)復(fù)方參花搽劑有較強(qiáng)的敏感性，抑菌圈大于19 mm,變形桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌對(duì)復(fù)方參花搽劑中度敏感。

表4 復(fù)方參花搽劑抑菌作用結(jié)果

注：-表示無(wú)抑菌作用

3 討 論

復(fù)方參花搽劑處方主要藥物為苦參，苦參屬豆科植物，為中草藥植物苦參的根，味苦，性寒，含有苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿等多種生物堿[4]，其中苦參堿含量較高。苦參堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C15H24N20，屬四環(huán)的噻嗪啶類，分子骨架為2個(gè)噻嗪啶的雜體[5]。其藥理作用很廣，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)、抗炎、抗病毒等作用。因此本研究采取以苦參中有效成份苦參堿的含量為考察指標(biāo)，采取L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝。最佳工藝為加8倍量水、煎煮3次、每次煎煮1.5 h。

復(fù)方參花搽劑對(duì)金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用。臨床實(shí)踐表明，苦參具有清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲(chóng)止癢，用于濕疹、濕瘡、皮膚瘙癢等癥[6]。金銀花清熱解毒[7]，為瘡瘍要藥；黃柏、蛇床子、地膚子、龍膽草、白芷等可以加強(qiáng)主藥清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲(chóng)之功，共為輔藥；全方為伍可用于蕁麻疹、濕疹、滲出性皮炎、濕疹、手足癬的治療。

試驗(yàn)結(jié)果表明，該制劑提取工藝合理可行，體外抑菌作用明顯，為規(guī)范配制制劑及臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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