BS69細(xì)胞原核表達(dá)載體的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)*

陳曉娟 張顏波 閆少春 邵 國

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物研究中心和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 泰安 271000)

BS69是一個多結(jié)構(gòu)域的蛋白，也稱之為ZMYND11(zinc finger，MYND domain containing 11)，它的氨基端含有Bromo結(jié)構(gòu)、PWWP結(jié)構(gòu)和PHD鋅指，而羧基端則含有一個MYND鋅指。研究顯示：BS69還存在一個不同的剪切本—BRAM1，它只是包括羧基端的一個部分[1]。

對BS69研究較多的是其對EB病毒(一種轉(zhuǎn)化的DNA病毒，主要感染人的鼻炎上皮細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞)LMP1蛋白的調(diào)控[2]。在全世界的總?cè)丝诋?dāng)中，大約95%的人群呈現(xiàn)EBV陽性，但由于人體其本身免疫系統(tǒng)的保護，這些人群大部分還是健康的。但是，如若某些免疫系統(tǒng)功能下降，EBV即可能與鼻咽癌、Burkitt淋巴癌、Hodgkin疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]。其次，EBV也很容易轉(zhuǎn)化為人靜止的B細(xì)胞，從而形成永生的淋巴細(xì)胞系。

此外，有證據(jù)表明：BS69能通過MYND結(jié)構(gòu)域，結(jié)合轉(zhuǎn)錄輔抑制因子N-CoR，來發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄抑制的作用，從而抑制它的轉(zhuǎn)錄活性[4]；而BS69除了可以與一系列的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用之外，與調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的蛋白-諸如染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物中的Brg1[5]蛋白、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、組蛋白去乙酰酶HDAC1等也可以發(fā)生相互作用[6]。因此，運用純生物化學(xué)的方法，在體外對BS69細(xì)胞進行原核表達(dá)，對于其在體外功能的研究是有長遠(yuǎn)意義的。所以，本次研究，我們將大腸桿菌作為生物反應(yīng)器，對BS69進行表達(dá)，為研究此生物的體外特征以及其生物學(xué)功能做好鋪墊。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

pEGFP-BS69質(zhì)粒由Dr.Jun Wan贈予[7]；Expand High Fidelity PCR System 及rapid ligation Kit 購于Roche公司；DNA凝膠回收試劑盒于Qiagen公司； Thrombin 購于Novus 公司；限制性內(nèi)切酶EcoRI 和BamHI 購于Takara 公司；DNA 回收試劑盒購于Qiagen 公司，GSTrap HP 購于GE 公司。

1.2 方法

1.2.1BS69基因的亞克隆 取1 μl由Dr.Jun Wan贈予pEGFP-BS69質(zhì)粒作為模板，按照Expand High Fidelity PCR System方法進行PCR擴增，所用引物為：F:5'- CGGGATCCATGGCACGTTTAACAAAAAGA-3';R:5'-GCGAATTCTCATTGGTGATGGTGATGATGTCTTTTCCGGCGGCAGGTGCG-3'。擴增條件為94 ℃ 變性5 min; 94 ℃、30 s;56 ℃、60 s；72 ℃、300 s;共進行30個循環(huán)，72 ℃延伸8 min。1.0% 瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進行電泳，將1.7 kb的擴增產(chǎn)物用Qiagen 公司的DNA凝膠回收試劑盒進行回收。

1.2.2原核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 將回收的1689bp的片段及PGEX-4T·3載體分別用EcoRI和BamHI雙酶切后回收所需要的目的片段，之后將回收的片段及質(zhì)粒用rapid ligation kit連接酶進行連接。連接后生成的連接產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，加入LB培養(yǎng)液，取少量菌液進行涂平板，次日挑取單個克隆進行擴增、搖菌、并提取質(zhì)粒。之后將提取的重組質(zhì)粒分別用BamHIⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切。將酶切正確的重組質(zhì)粒測序并鑒定。

1.2.3PGEX-4T·3-BS69質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá) 將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌BL21中，使其篩選陽性表達(dá)菌株，并接種于選擇性LB液體培養(yǎng)基中( 50 g/ml amp )，37 ℃ ，225 r/m in，振蕩培養(yǎng)至OD600=0.7時，加入IPTG 1 mol /L于菌液中，此時IPTG的終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)5 h后，收獲菌體；同時設(shè)空質(zhì)粒的對照組。

1.2.4蛋白純化 將按上述方法誘導(dǎo)培養(yǎng)后收集的菌體，加入5 倍體積冰冷的PBS清洗3遍，然后再用1 ml冰冷的PBS對菌體進行懸浮；之后在冰浴上用超聲破碎儀破菌99次，間歇5 s，每次4 s，電壓為200V～300 V，13000 rpm，4 ℃，離心機離心20 min，將上清液移入另一支干凈的離心管中。之后上清液按照 GSTrap 說明書進行蛋白純化，經(jīng)Thrombin 酶切洗脫下來的蛋白跑SDS-PAGE膠電泳進行鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增目的片段

通過PCR進行擴增，將產(chǎn)物進行1﹪瓊脂糖凝膠電泳，將得到1689bp左右的目的片段回收。

2.2 重組表達(dá)載體PGEX-4T·3-BS69的構(gòu)建及酶切鑒定

將PCR 產(chǎn)物及PGEX-4T·3以EcoRI和Bam HⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR 純化試劑盒純化去除小片段，經(jīng)rapid ligation Kit進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)菌中。挑取單克隆，進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)Bam HⅠ和EcoRI雙酶切，1﹪瓊脂糖凝膠電泳檢查片段大小，表明目的片段已插入到表達(dá)載體中，電泳結(jié)果見圖1。

M：marker；1：pGEX-BS69質(zhì)粒BamHI和EcoRI酶切，切出1.7kb和4.3kb兩個片段

2.3 PGEX-4T·3-BS69序列測定

選取其中6個克隆送公司進行測序，測得序列與Genbank登記的大鼠的BS69基因同源序列完全相同即為大鼠的PGEX-4T·3-BS69質(zhì)粒。

2.4 BS69蛋白純化

含有PGEX-4T·3-BS69的BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，分離上清中含有GST-BS69融合蛋白，融合蛋白與GSTrap結(jié)合后利用Thrombin 酶切將BS69釋放出來，經(jīng)SDS-PAGE分析( 圖2),可明顯看到預(yù)期BS69分子量大小相符( 約70kD ) 的條帶。

M：marker；BS69：純化的BS69蛋白

3 討 論

BS69最初由Hateboer等人鑒定出來，并因為其分子量為69kda而進行命名。他們還用Northern雜交的方法，分析小鼠幾種不同組織中BS69的表達(dá)水平，并在所有的測試組織中發(fā)現(xiàn)一個轉(zhuǎn)錄本，大約有4.7kb,且檢測其在睪丸、腦、肺中表達(dá)量較低，而在腎臟中的表達(dá)量最高。同時還發(fā)現(xiàn)BS69作為一種腺病毒結(jié)合蛋白，它的主要功能是通過289R EIA腫瘤蛋白抑制反式激活，在與各種轉(zhuǎn)錄因子的相互聯(lián)系中充當(dāng)協(xié)阻抑物的角色，從而抑制EIA的反式活化作用和轉(zhuǎn)錄促進作用[8,9]。但是迄今為止，BS69的很多特點和確切的生物學(xué)功能仍有待于研究。

除此之外，BS69還可能參與細(xì)胞的衰老[10]。例如在人的原代成纖維細(xì)胞IMR90中，使用RNA干擾的方法使BS69的表達(dá)降低時，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的擴增速度變得很慢，這一現(xiàn)象說明BS69可能參與了細(xì)胞周期的調(diào)控[11]；與此用時，研究者還發(fā)現(xiàn)BS69作為一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控的阻遏因子，可能也會通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來發(fā)揮其功能；因此，經(jīng)過進一步的分析發(fā)現(xiàn)，p21Cip1在敲除BS69之后表達(dá)量會增高，p21作為一種細(xì)胞周期的抑制因子，在衰老細(xì)胞的表達(dá)中被誘導(dǎo)性升高，但是p53和p16等基因的表達(dá)卻沒有什么改變。因此，BS69是否與細(xì)胞的衰老有聯(lián)系也有待于研究。

我們成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體PGEX-4T·3-BS69，并對其進行了體外表達(dá)，為進一步研究BS69的功能奠定了基礎(chǔ)。

本研究為BS69蛋白功能的研究，和深入探討EB病毒誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制奠定基礎(chǔ),并以期對揭開病毒復(fù)制和對細(xì)胞產(chǎn)生的影響，設(shè)計藥物阻止病毒復(fù)制、EBV 及相關(guān)腫瘤的預(yù)防和治療提供一些新的線索。

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