4-氨基安替比林法和鄰-甲聯(lián)苯胺法測(cè)定游離血紅蛋白結(jié)果比較

冀 慧

(安陽(yáng)中心血站 河南 安陽(yáng) 455000)

游離血紅蛋白(FHb)含量測(cè)定是血站全血及成分血質(zhì)量要求和質(zhì)量控制的檢查項(xiàng)目之一，也是臨床溶血性疾病和溶血性輸血反應(yīng)常用的輔助檢查方法。2012年新版《全血及成分血質(zhì)量要求 GB18469-2012》［1］中對(duì)所有含紅細(xì)胞的制品均要求進(jìn)行血漿或上清液FHb的含量測(cè)定?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程2012版》［2］推薦方法為鄰-甲聯(lián)苯胺法，該方法操作步驟復(fù)雜，試劑需新鮮配制，影響因素較多，重復(fù)性和穩(wěn)定性較差。目前部分血液中心和血站使用三波長(zhǎng)法［3］、紫外分光光度法［4］等進(jìn)行FHb的測(cè)定，但未發(fā)現(xiàn)使用4-氨基安替比林比色法測(cè)定FHb的含量，4-氨基安替比林比色法目前有市售的試劑盒，操作簡(jiǎn)單快捷。筆者比較了鄰-甲聯(lián)苯胺法和4-氨基安替比林法測(cè)定FHb的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性及測(cè)量時(shí)的注意事項(xiàng)，探討采供血機(jī)構(gòu)測(cè)定FHb含量最適宜的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)V-18D);37℃恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗DNP-9162BS-Ⅲ型);血球計(jì)數(shù)儀(日本KX-21)。

1.2 試劑及樣品

1.2.1 一般試劑準(zhǔn)備:鄰-甲聯(lián)苯胺(分析純，批號(hào):20130723，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);30%過(guò)氧化氫溶液(分析純，批號(hào)20130518，天津市津北精細(xì)化工有限公司);冰醋酸溶液(分析純，批號(hào)20121113，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。鄰-甲聯(lián)苯胺溶液:稱(chēng)取鄰-甲聯(lián)苯胺200 mg，溶于冰醋酸60 ml，溶解后加蒸餾水至100 ml，保存于冰箱中，可用8～12周。1%過(guò)氧化氫溶液:由30%的過(guò)氧化氫溶液配制而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。10%冰醋酸溶液:由冰醋酸溶液用蒸餾水稀釋而成，現(xiàn)用現(xiàn)配。血漿游離血紅蛋白測(cè)定試劑盒(北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司，20131202);全血質(zhì)控物(MAKER，111312G);KX-21 稀 釋 液 (日 本，20130805);KX-21溶血?jiǎng)?日本，20130731)。

1.2.2 血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的制備:新鮮全血5 ml離心，1 500 g離心15 min后棄去上層血漿及白膜層;加3倍體積0.9%氯化鈉溶液，混勻后離心，430 g離心10 min，棄去上清液，重復(fù)3次得到壓積紅細(xì)胞;加15 ml蒸餾水，輕搖30 min后離心，10 000 g離心30 min，棄去下層沉淀［5］，用血球計(jì)數(shù)儀測(cè)其濃度;用0.9%氯化鈉溶液調(diào)節(jié)濃度至100 g/L，于低溫冰箱中保存，得到FHb標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液［6］，用時(shí)稀釋成相應(yīng)濃度。

1.3 方法

1.3.1 鄰-甲聯(lián)苯胺操作方法［7］:試劑處理后，迅速在435 nm波長(zhǎng)下比色，光徑10 mm，空白調(diào)零，結(jié)果計(jì)算:FHb/(mg/L)=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)×100。正常人群FHb參考值 ＜40 mg/L［7］，解凍紅細(xì)胞 FHb參考值≤1 000 mg/L［1］，紅細(xì)胞制品中FHb的含量一般都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人群參考值。具體步驟見(jiàn)表1。

表1 鄰-甲聯(lián)苯胺法操作步驟

1.3.2 4-氨基安替比林操作方法:按照血漿游離血紅蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作(北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司)。在505 nm波長(zhǎng)下比色，光徑10 mm，空白調(diào)零，結(jié)果計(jì)算:FHb(mg/L)=A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)×100，見(jiàn)表2。

1.3.3 線(xiàn)性范圍:將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成 50、100、150、200、250 mg/L，用鄰-甲聯(lián)苯胺比色法，平行分析3次;將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成50、100、200、300、400 mg/L，用4-氨基安替比林比色法，平行分析3次。

表2 4-氨基安替比林法操作步驟

1.3.4 精密度:將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成100、500、1 000 mg/L，用兩種方法分別測(cè)定其FHb含量，每份樣品平行分析5次。統(tǒng)計(jì)分析5個(gè)平行樣品之間的變異性。

1.3.5 準(zhǔn)確性:將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成100、500、1 000 mg/L，用兩種方法分別測(cè)定其FHb含量，每份樣品平行分析3次，統(tǒng)計(jì)分析測(cè)定的準(zhǔn)確性。

1.3.6 穩(wěn)定性:將FHb標(biāo)準(zhǔn)品(100 g/L)用0.9%氯化鈉溶液分別稀釋成200、400、800 mg/L，用兩種方法分別測(cè)定其 FHb含量及放置5、10、30、60 min后的FHb吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0進(jìn)行處理，F(xiàn)Hb含量與吸光度的關(guān)系采用相關(guān)性分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線(xiàn)性范圍 鄰-甲聯(lián)苯胺法:FHb≤250 mg/L時(shí)有良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.996，P ＜0.05);4-氨基安替比林法:FHb≤400 mg/L時(shí)有良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.999，P ＜0.05)，見(jiàn)表 3。4-氨基安替比林法的線(xiàn)性范圍大于鄰-甲聯(lián)苯胺法的線(xiàn)性范圍，用線(xiàn)性范圍寬的4-氨基安替比林法測(cè)定高濃度FHb含量時(shí)可減少對(duì)測(cè)定樣品的稀釋倍數(shù)。

表3 兩種方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品含量與吸光度關(guān)系

2.2 精密度 鄰-甲聯(lián)苯胺法:低濃度樣品 CV=4.01%，中濃度樣品 CV=8.91%，高濃度樣品 CV=7.52%;4-氨基安替比林法:低濃度樣品CV=2.61%，中濃度樣品CV=3.63%，高濃度樣品CV=4.61%。兩種方法變異系數(shù)均≤10%，但4-氨基安替比林法在測(cè)定高中低不同濃度樣品時(shí)的變異系數(shù)相差不大，鄰-甲聯(lián)苯胺法在測(cè)定高中濃度樣品時(shí)變異系數(shù)相差較大，4-氨基安替比林法的試驗(yàn)重復(fù)性要優(yōu)于鄰-甲聯(lián)苯胺法，見(jiàn)表4。

表4 兩種方法測(cè)定精密度試驗(yàn)結(jié)果(mg/L)

2.3 準(zhǔn)確性 鄰-甲聯(lián)苯胺法(平均值為93.02%)和4-氨基安替比林法(平均值為93.32%)在測(cè)定高中低不同濃度樣品時(shí)的準(zhǔn)確度相差不大，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見(jiàn)表5。

表5 兩種方法測(cè)定準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性 鄰-甲聯(lián)苯胺法反應(yīng)結(jié)束后，高中低3個(gè)濃度樣品的吸光度值隨時(shí)間的不斷延長(zhǎng)而不斷降低，呈直線(xiàn)向下的趨勢(shì)，見(jiàn)圖1;4-氨基安替比林法反應(yīng)結(jié)束后，高中低3個(gè)濃度樣品的吸光度值沒(méi)有太大變化，基本上呈直線(xiàn)趨勢(shì)，見(jiàn)圖2。4-氨基安替比林法因試劑中加入一定量的穩(wěn)定劑，反應(yīng)結(jié)束后顏色變化很穩(wěn)定。4-氨基安替比林法的穩(wěn)定性要大大優(yōu)于鄰-甲聯(lián)苯胺法。

圖1 鄰-甲聯(lián)苯胺法測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性

3 討論

圖2 4-氨基安替比林法測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性

FHb是血漿中血紅蛋白的含量，是血液保存質(zhì)量測(cè)定的常規(guī)指標(biāo)。在血液采集和血液成分制備過(guò)程中有時(shí)會(huì)造成紅細(xì)胞破裂而釋放出血紅蛋白。如輸入的血液中含有過(guò)量的FHb，會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，主要原因在于Hb中的血紅素可引起自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷，比較嚴(yán)重的后果是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用［8］;另外，輸入過(guò)量的Hb還可迅速結(jié)合掉循環(huán)系統(tǒng)中的NO，引起血管無(wú)法舒張，最終導(dǎo)致受血者血壓升高，缺血缺氧，甚至威脅生命［9］。2012年新版《全血及成分血質(zhì)量要求GB18469-2012》中對(duì)血站制備的所有含紅細(xì)胞的制品均要求進(jìn)行血漿或上清液FHb的含量測(cè)定?！堆炯夹g(shù)操作規(guī)程2012版》推薦方法為鄰-甲聯(lián)苯胺法，該方法操作步驟復(fù)雜，試劑需新鮮配制，影響因素較多，而且所用試劑冰醋酸和過(guò)氧化氫對(duì)人體皮膚和黏膜均有刺激性和腐蝕性，且鄰-甲聯(lián)苯胺屬于有機(jī)有毒品，對(duì)人體還有一定的致癌作用。因冰醋酸具有揮發(fā)性，過(guò)氧化氫易氧化分解，所以冰醋酸溶液和過(guò)氧化氫溶液均需要新鮮配制，否則二者含量都會(huì)隨保存時(shí)間的增加而不斷減少，引起樣品吸光度值變小。我們?cè)谟绵?甲聯(lián)苯胺法測(cè)定較多樣品時(shí)，如測(cè)定時(shí)間超過(guò)3 h，則需重新配制過(guò)氧化氫溶液和冰醋酸溶液，并將過(guò)氧化氫溶液配置后盛放于棕色瓶中避光保存;鄰-甲聯(lián)苯胺溶液雖說(shuō)可在冰箱保存8～12周，但我們發(fā)現(xiàn)鄰-甲聯(lián)苯胺溶液在保存過(guò)程中顏色會(huì)逐漸加深，如顏色明顯變深，則需重新配制。4-氨基安替比林法目前有市售的整套試劑盒，無(wú)需新鮮配制試劑，大大簡(jiǎn)化了操作步驟，減少了有害試劑對(duì)人體的傷害。因試劑中含有穩(wěn)定劑，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。綜上所述，4-氨基安替比林法相對(duì)于鄰-甲聯(lián)苯胺法更適合采供血機(jī)構(gòu)測(cè)定FHb含量使用。

［1］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.全血及成分血質(zhì)量要求［S］.GB18469-2012.

［2］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.血站技術(shù)操作規(guī)程(2012版)［S］.衛(wèi)醫(yī)政發(fā)［2012］1號(hào).

［3］ 于清，王紅，劉嘉馨，等.游離血紅蛋白測(cè)定:三波長(zhǎng)法和鄰聯(lián)甲苯胺法的比較研究［J］.中國(guó)輸血雜志，2012，25(2):138-141.

［4］ 王莉，張淑琴，趙君，等.紫外分光光度法檢測(cè)血漿游離血紅蛋白［J］.中國(guó)輸血雜志，2006，19(6):477-479.

［5］ Cripps C M.Rapid method for the estimation of plasma haemoglobin levels［J］.J Clin Pathol，1968，21(1):110-112.

［6］ 掌友湖，梁?jiǎn)⒅?，程玉?全血質(zhì)控物配制標(biāo)準(zhǔn)液在血漿游離血紅蛋白測(cè)定中的應(yīng)用［J］.中國(guó)輸血雜志，2009，22(10):823-824.

［7］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程［M］.第3版.南京:東南大學(xué)出版社，2006:258.

［8］ 吳波，方國(guó)恩.游離血紅蛋白主要測(cè)定方法及輸入過(guò)量對(duì)機(jī)體影響的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2008，25(5):612-614.

［9］ Gross S S，Lane P.Physiological reactions of nitric oxide and hemoglobin:a radical rethink［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96(18):9967-9969.