HPLC測定不同廠家六味地黃丸中丹皮酚的含量*

宋 曉 孫曉慧 李 珂

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

六味地黃丸的成分由熟地黃、山茱萸(制)、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉組成。因由六位中藥材組成，其中熟地黃為君藥，故名，是滋補(bǔ)腎陰的基礎(chǔ)方劑[1]。牡丹皮具有良好的清熱、止血、活血、消瘀等功能，丹皮酚是牡丹皮的重要有效成分[2]。目前，丹皮酚的含量測定有高效液相色譜法、分光光度法、氣相色譜法、薄層掃描法、膠束毛細(xì)管電泳法等。

本次試驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜法對丹皮酚含量進(jìn)行測定[3]，2010年版藥典對六味地黃丸及六味地黃丸(濃縮丸)中牡丹皮的控制也是采用HPLC法測定丹皮酚的含量，但同時(shí)對比控制九個(gè)廠家的丹皮酚的含量尚屬首次。本法分離效率高，靈敏度好，能較好地測定不同廠家的六味地黃丸中丹皮酚的含量，從而為廠家優(yōu)化處方含量以及患者選藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津高效液相色譜儀(島津國際貿(mào)易有限公司)、不銹鋼過濾器(DP-01)溶劑過濾器加真空(DP-01 VACOOM PRESSURE PUMP)、KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠)。

1.2試藥 丹皮酚對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110708-200505)；天福康六味地黃丸(1號(hào))濃縮丸(批號(hào)：20110919，馬鞍山神鹿科瑞藥業(yè)有限公司)；同仁堂六味地黃丸(2號(hào))水蜜丸(批號(hào)：1035608，北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)；修正六味地黃丸(3號(hào)) 濃縮丸(批號(hào)：111102，通藥制藥集團(tuán)股份有限公司)；太極六味地黃丸(4號(hào)) 濃縮丸(批號(hào)：1112222，太極集團(tuán)重慶制藥二廠有限公司)；九芝堂六味地黃丸(5號(hào))濃縮丸(批號(hào)：201109060，九芝堂股份有限公司)；仁和六味地黃丸(6號(hào)) 濃縮丸(批號(hào)：110507，江西藥都樟樹制藥有限公司)；華佗六味地黃丸(7號(hào)) 濃縮丸(批號(hào)：20110305，安徽華佗國藥股份有限公司)；仲景六味地黃丸(8號(hào)) 濃縮丸(批號(hào)：110640，河南省宛西制藥股份有限公司)；孫真人六味地黃丸(9號(hào)) 濃縮丸(批號(hào)：20111031，河南省濟(jì)源市濟(jì)世藥業(yè)有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1色譜條件

2.1.1色譜條件的選擇 色譜柱：Diamonsil C18柱(250 nm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(70∶30)，流速：1.0 ml/min；檢測波長：274 nm；柱溫：20℃。進(jìn)樣量：20 μl。取空白溶劑甲醇、丹皮酚對照品和六味地黃丸樣品溶液各20 μl進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果丹皮酚與樣品中其他成分達(dá)到基線分離，分離度為1.59，理論塔板數(shù)大于2000。

2.1.2紫外吸收波長的選擇 對丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，丹皮酚的紫外吸收光譜如圖所示(圖2)，最大吸收波長為274 nm，選擇274 nm作為檢測波長。

2.2溶液的制備

2.2.1丹皮酚對照品溶液 精密稱取丹皮酚對照品適量，加甲醇溶解并定容，配置成100 μg/ml的丹皮酚儲(chǔ)備液。精密量取丹皮酚儲(chǔ)備液0.02，0.08，0.24，0.4，0.6，1.5 ml分別置于5 ml棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，得濃度分別為0.4，1.6，4.8，8.0，12，30 μg/ml的丹皮酚對照品溶液。

2.2.2六味地黃丸樣品溶液 取六味地黃丸研細(xì)，精密稱取0.5 g于50 ml棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。超聲20 min，放至室溫，搖勻，高速離心5 min，5000 r/min，上清液即為六味地黃丸樣品溶液。

2.3方法學(xué)考察和樣品測定

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取不同濃度的丹皮酚對照品溶液進(jìn)樣20 μl，以丹皮酚峰面積(A)對丹皮酚濃度(C)進(jìn)行回歸處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=123549C+75111，r=0.9997。表明丹皮酚在0.4～30 μg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取常溫避光條件下放置的六味地黃丸樣品溶液20 μl，按照上述色譜條件分別在0，1，3，5，8，10，24 h進(jìn)樣，測定丹皮酚的峰面積，RSD=2.20% ，結(jié)果表明供試品在24小時(shí)內(nèi)常溫避光條件下基本穩(wěn)定。

2.3.3精密度試驗(yàn) 取同一廠家的六味地黃丸供試品溶液20 μl，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其日內(nèi)精密度。結(jié)果重復(fù)進(jìn)樣平均峰面積711294.7，RSD=1.04%，表明進(jìn)樣樣品精密度良好。

2.3.4重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一廠家的六味地黃丸供試品6份各0.1 g，置于25 ml容量瓶中，加甲醇定容，超聲20 min，搖勻后離心5 min，5000 r/min，分別取上清液20 μl進(jìn)樣測定。結(jié)果6份樣品中丹皮酚的平均含量為1.24 mg/g，RSD為1.61%。表明本方法的重復(fù)性良好。

圖1 甲醇(A)、丹皮酚對照品(B)和六味地黃丸樣品(C)的色譜圖

圖2 丹皮酚紫外吸收光譜圖

2.3.5加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一廠家(1號(hào))的六味地黃丸樣品粉末9份，編號(hào)1-9，分別置于5 ml棕色容量瓶，1,2,3為一組，分別加入0.7 ml丹皮酚儲(chǔ)備液；4,5,6為一組，分別加入0.8 ml丹皮酚儲(chǔ)備液；7,8,9為一組，分別加入0.9 ml丹皮酚儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。超聲取上清液20 μl進(jìn)樣測定，結(jié)果見表1。

2.3.6樣品含量測定 分別取9個(gè)廠家六味地黃丸各三份，制備樣品溶液，分別進(jìn)樣20 μl，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，記錄色譜圖。測定結(jié)果見表2。

表1 丹皮酚加樣回收率測定

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討 論

3.1檢測波長的選擇 對丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外光譜掃描，丹皮酚最大吸收波長為274 nm，與文獻(xiàn)一致[4]，最終選用274 nm作為檢測波長。

3.2超聲提取時(shí)間的選擇 甲醇超聲提取丹皮酚的時(shí)間，分別進(jìn)行了10 min，20 min，30 min，40 min的超聲提取實(shí)驗(yàn)[5]，進(jìn)樣測定丹皮酚含量，發(fā)現(xiàn)20 min，30 min和40 min提取量相近多于10 min的提取量，最終選擇20 min為實(shí)驗(yàn)超聲提取時(shí)間。

3.3含量比較 在本實(shí)驗(yàn)中建立的HPLC法簡便、快速、重復(fù)性高、精密度好，可以用于測定六味地黃丸中丹皮酚含量。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中測量的9個(gè)廠家的六味地黃丸中，除1號(hào)低于2010年版藥典每1 g含牡丹皮以丹皮酚計(jì)不得少于1.8 mg外，其余六味地黃丸(濃縮丸)中丹皮酚含量都符合規(guī)定；同仁堂(水蜜丸)中的丹皮酚含量也符合每克以丹皮酚計(jì)不得少于0.9 mg的規(guī)定；但九個(gè)廠家的丹皮酚相對含量仍有差別。

[1] 張葉,吳劍,李端,等.超微電極快速掃描法檢測六味地黃丸中的丹皮酚[J].遼寧化工,2011,40(8):884-885.

[2] 李珂,賈寶秀,劉彩紅.高效液相色譜法測定加味逍遙丸中丹皮酚的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,29(10):1345-1355.

[3] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010：597-599.

[4] 李珂,齊永秀,李玉琴,等.HPLC法測定徐長卿中丹皮酚的含量[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,31(11)：856-858

[5] 徐飛,尹蓉莉,鐘玲,等.超聲提取六味地黃丸復(fù)方的工藝研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2006,17(8):1432-1434.