5-BrdU標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對順鉑耳中毒豚鼠耳蝸的保護(hù)作用

張翠翠

以順鉑為代表的鉑類化合物主要用于腫瘤化療，其最常見的毒副反應(yīng)是以聽功能下降為表現(xiàn)的耳毒性，因此如何有效預(yù)防和治療順鉑耳毒性成為研究的熱點(diǎn)。目前治療順鉑耳毒性主要是用活血化瘀類藥物如川芎嗪等，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是體內(nèi)具有更新能力和分化潛能的細(xì)胞，可誘導(dǎo)分化為其他細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)將5-BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine)標(biāo)記的MSCs通過鼓階注射法移植入順鉑耳毒性模型豚鼠耳蝸內(nèi)，探討其在順鉑耳毒性模型豚鼠耳蝸內(nèi)的存活、分化及細(xì)胞增殖情況，以期為順鉑耳毒性細(xì)胞療法的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 選擇健康8周齡清潔級豚鼠 20只，聽力無異常，體重250 g左右，雌雄不限，購于濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胰蛋白酶、鼠抗BrdU，抗鼠BrdU抗體 (武漢博士德生物工程有限公司) 二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 顯色試劑(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1MSCs體外分離、培養(yǎng)及純化 隨機(jī)取抽4只豚鼠的骨髓，采用頸椎脫臼處死豚鼠，打開雙側(cè)股骨、脛骨，D-Hank液沖洗骨髓腔多次，篩網(wǎng)(100目)過濾，按密度梯度離心法[1]將MSCs分離，將Percoll(密度為1.073 g/ml)置于試管的底部，然后沿管壁緩慢滴加骨髓懸液(Percoll與骨髓比例 1：1)，離心(離心力為 400 g，時(shí)間25 min)，分離出位于界面層灰白色的細(xì)胞，用 L-DMEM(10%胎牛血清、 100 mg/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)離心洗滌 2 次(800 r/min，5 min)，接種在培養(yǎng)液中(密度3.0×105/cm2)，放入CO2培養(yǎng)箱，48 h 后首次換液，培養(yǎng)液每 3 d 更換。傳代培養(yǎng)待細(xì)胞接近80%鋪滿瓶底，將原培養(yǎng)液棄去，用 D-Hank 液沖洗 3次，加入 0.25%的胰蛋白酶和 0.02%的 EDTA 消化細(xì)胞，顯微鏡下當(dāng)細(xì)胞收縮變圓時(shí)終止消化，加入含少量血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，離心(800 r/min，5 min)，棄上清液。加入完全培養(yǎng)液充分吹打成單細(xì)胞懸液，而后按1∶3傳代于培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細(xì)胞鋪滿瓶底后，重復(fù)上述操作，培養(yǎng)至第3代。

1.2.25-BrdU標(biāo)記MSCs 細(xì)胞出現(xiàn)80%融合時(shí)，棄掉舊的培養(yǎng)基，用濃度為10 g/ml 5-BrdU標(biāo)記培養(yǎng)基，置于37 ℃， 5% CO2培養(yǎng)箱中培育15 min。棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗后，備用。

1.2.3豚鼠ABR檢測 16只豚鼠建立順鉑耳毒性模型，建模前后及細(xì)胞移植前后分別行ABR檢測。腹腔注射1 %戊巴比妥鈉(30 mg/kg)[2]麻醉豚鼠，將豚鼠固定后在隔聲屏蔽室內(nèi)檢測。采用短聲(10次/秒)刺激，由聲刺激器電脈沖(輸入波寬 0.1 ms)經(jīng)耳機(jī)輸出 (耳機(jī)緊靠豚鼠耳廓，距離外耳道約 0 .5 cm左右)。放大器帶通濾波為80～3 000 Hz，增益2 000，疊加200次。記錄電極置于顱頂正中部，參考電極與接地電極分別放于給聲耳及對側(cè)耳乳突部。以波IV剛出現(xiàn)時(shí)的刺激聲強(qiáng)度為反應(yīng)閾。

1.2.4順鉑耳毒性模型的建立及內(nèi)耳細(xì)胞移植 ABR檢測完后，采用腹腔注射順鉑4 mg/kg-1·d-1，連續(xù)7 d，建立豚鼠順鉑耳毒性模型。建模后，1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉豚鼠，消毒后，在右耳后上部切開，暴露并打開聽泡，用電鉆在耳蝸底開孔透過耳蝸骨壁進(jìn)入鼓階打開直徑0.1 mm 的圓孔，隨即可見清亮外淋巴液流出，在微量泵(TJ-1A Syringe Pump Controller) 控制下將0.1 μl 5-BrdU標(biāo)記的MSCs注入右耳，將上述造孔處用醫(yī)用耳腦膠封閉，縫合切口。左耳為對照耳，手術(shù)同右耳；然后注射生理鹽水后封閉鑿孔，縫合切口。術(shù)后肌注青霉素(華北制藥股份有限公司)預(yù)防感染，1 次/日，持續(xù)給藥 3天。

1.2.5內(nèi)耳標(biāo)本處理 豚鼠在移植結(jié)束后第1、4 w檢測ABR后各處死8只，水合氯醛麻醉后快速斷頭，分別取左耳和右耳聽泡，第1、4 w取出的左、右耳聽泡均分成兩部分：一部分用于硝酸銀染色，開放前庭窗和蝸窗；一部分用于免疫組織化學(xué)染色，放入固定液中過夜，10% EDTA中脫鈣14 d。梯度酒精脫水、二甲苯透明，平行蝸軸方向用石蠟包埋，切片，厚約5 μm。

1.2.6硝酸銀染色 打開前庭窗和蝸窗的聽泡，用硝酸銀溶液(0.5%新鮮配制)從蝸尖處灌注，然后灌注4%多聚甲醛溶液，并于多聚甲醛溶液固定2 h后，在解剖顯微鏡下剝離耳蝸基底膜，鋪片，中性樹膠封片。光鏡下判定毛細(xì)胞缺失情況。

1.2.7BrdU免疫組織化學(xué)染色 根據(jù)抗原熱修復(fù)技術(shù)中貼片改良法，用陽離子玻片(購于三頓公司)撈片，過夜后，放至裝有加熱到95 ℃的枸櫞酸鈉溶液(0.01 M)的50 ml燒杯中，用恒溫水浴鍋熱修復(fù)30 min后冷卻至室溫。清洗后，置于鹽酸(2 mol/L)中變性30 min，PBS 漂洗(5 min×3次)，用3 %雙氧水以去除內(nèi)源性過氧化物酶15 min，室溫下用 5% BSA封閉 1 h，采用SABC法行免疫組織化學(xué)染色，一抗為小鼠抗BrdU單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，1:1 000)，室溫孵育過夜，二抗為生物素化兔抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司，1:200)，37 ℃孵育2 h， ABC 復(fù)合物(武漢博士德生物工程有限公司，1:200)37 ℃孵育1 h，用0.05 %DAB(武漢博士德生物工程有限公司)顯色。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察耳蝸內(nèi)BrdU染色陽性細(xì)胞判斷移植后細(xì)胞增殖和分布情況。

2 結(jié)果

2.1動(dòng)物存活情況 術(shù)后24小時(shí)實(shí)驗(yàn)豚鼠死亡1只，解剖死亡動(dòng)物的內(nèi)耳，未見出血、化膿。

2.2造模前后及植入MSCs后1、4 w ABR反應(yīng)閾 豚鼠順鉑耳毒性造模前后ABR反應(yīng)閾和內(nèi)耳注射后1周、4周ABR反應(yīng)閾見表1，可見，左耳注射生理鹽水后ABR閾值較造模前均升高(P<0.05)，而右耳注射MSCs后4 w ABR反應(yīng)閾較造模后明顯降低(P<0.05)，表明鼓階注射MSCs可修復(fù)大鼠聽功能損傷。

表1 豚鼠造模前后及MSCs注射后1、4 w左、右耳 ABR反應(yīng)閾

注：*與右耳造模后比較，P<0.05，△與各自造模前比較，P<0.05

2.3耳蝸毛細(xì)胞鋪片 光鏡下顯示，右側(cè)耳蝸移植5-BrdU標(biāo)記的MSCs 1 w后，MSCs細(xì)胞生長、增殖，排列規(guī)則(圖1a)，4 w后，MSCs細(xì)胞進(jìn)一步生長、增殖，排列規(guī)則整齊，邊界清楚，且無缺失及損傷(圖1b)；左側(cè)耳蝸?zhàn)⑸渖睇}水后于1 w后見毛細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂(圖2a)，4 w后明顯損傷，毛細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)紊亂，排列不整齊，外毛細(xì)胞缺失數(shù)目增加，甚至成片缺失(圖2b)。

2.4蝸內(nèi)移植細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果 右側(cè)耳蝸移植5-BrdU標(biāo)記的MSCs 1 w后耳蝸內(nèi)見BrdU染色陽性細(xì)胞，胞漿呈棕黃色，細(xì)胞呈紡錘形或卵圓形，排列不規(guī)則(圖3a)，BrdU染色陽性細(xì)胞主要分布于耳蝸的外淋巴；4 w后耳蝸內(nèi)BrdU染色陽性細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞呈圓形且細(xì)胞核大，排列逐漸規(guī)則(圖3b)。左側(cè)耳蝸?zhàn)⑸渖睇}水后1、4 w均未見BrdU染色陽性細(xì)胞(圖4)。

3 討論

目前，順鉑的耳毒性一直缺乏有效的藥物治療手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有很強(qiáng)的分化潛能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MSCs在特定條件下可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[3]，能夠修復(fù)缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)細(xì)胞[4]，在體內(nèi)能夠增殖并分化從而修復(fù)已受損神經(jīng)[5]。MSCs在特定條件下還可以誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳功能細(xì)胞[6]。耳蝸移植MSCs治療耳聾是目前研究的熱點(diǎn)，目前耳蝸內(nèi)移植MSCs采用經(jīng)耳蝸鼓階微造孔法注射[7]。MSCs經(jīng)鼓階打孔注射[8]導(dǎo)入耳蝸?zhàn)顬楹线m。實(shí)驗(yàn)研究表明MSCs既能在內(nèi)耳中表達(dá)毛細(xì)胞從而使受損的耳蝸恢復(fù)功能又不影響耳蝸原有的功能[9]。BrdU結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶脫氧核苷類似，在DNA合成時(shí)能取代胸腺嘧啶整合到新細(xì)胞核DNA中。干細(xì)胞治療的研究中主要采用BrdU標(biāo)記及示蹤技術(shù)，BrdU標(biāo)記具有不影響MSCs生長的優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確反映移植細(xì)胞的增殖、細(xì)胞分化及其遷移過程[10]，是可靠的示蹤方法[11]。

圖1a 右側(cè)耳蝸移植后1 w MSCs細(xì)胞生長、增殖，排列規(guī)則 (×400)圖1b 右側(cè)耳蝸移植后4 w MSCs細(xì)胞生長、增殖，排列規(guī)則邊界清楚(×400) 圖2a 左側(cè)耳蝸移植后1 w毛細(xì)胞毛細(xì)胞腫脹結(jié)構(gòu)紊亂(×400)圖2b 左側(cè)耳蝸移植后4 w毛細(xì)胞排列排列不整齊，甚至成片缺失(×400)

圖3a 右側(cè)耳蝸1 w BrdU染色陽性細(xì)胞(×200)圖3b 右側(cè)耳蝸4 w BrdU 染色陽性細(xì)胞 (×200) 圖4a 左側(cè)耳蝸1 w未見BrdU染色陽性細(xì)胞(×200)圖4b 左側(cè)側(cè)耳蝸4 w未見BrdU 染色陽性細(xì)胞 (×200)

本實(shí)驗(yàn)采用耳蝸毛細(xì)胞鋪片和BrdU免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，與左側(cè)耳蝸(注入生理鹽水)相比，右側(cè)耳蝸(移植BrdU標(biāo)記的MSCs)MSCs細(xì)胞生長、增殖，排列規(guī)則；右側(cè)耳蝸在不同時(shí)間段內(nèi)均可見BrdU標(biāo)記后的MSCs在耳蝸內(nèi)存活，增殖，隨著時(shí)間延長陽性細(xì)胞逐漸增多，進(jìn)一步證明了細(xì)胞的增殖能力；ABR檢測顯示，實(shí)驗(yàn)耳在術(shù)后28 d ABR閾值能夠恢復(fù)到造模前正常水平，說明5-BrdU標(biāo)記的MSCs植入順鉑耳中毒豚鼠耳蝸中能存活、增殖生長，從而對豚鼠聽功能起到保護(hù)作用。

本研究采用的MSCs移植為將來在人工耳蝸植入術(shù)的同時(shí)實(shí)施細(xì)胞移植或基因治療提供了可能，以期能為順鉑耳毒性細(xì)胞療法的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

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