大鼠聽皮層發(fā)育關鍵期膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達及聽功能變化*

張志敏 華清泉 楊琨 吳莎

出生后早期，人和哺乳動物的聽覺系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，在解剖和功能上具有相當大的可塑性，能夠根據(jù)環(huán)境變化作出適應性的改變，功能和結構逐漸成熟，這段時間是聽覺中樞發(fā)育的關鍵期。大鼠出生后聽覺發(fā)育的關鍵期從第12天開始, 到第30天結束，而出生后的前28天以內(nèi)是其聽皮層發(fā)育的關鍵期[1～3]。星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，AST)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中體積最大、數(shù)量最多、分布最廣的一種膠質(zhì)細胞，其數(shù)量幾乎占到大腦總細胞數(shù)的50%，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形膠質(zhì)細胞成熟的特異性標志[4]。神經(jīng)細胞發(fā)生、發(fā)育的全過程AST均發(fā)揮重要作用[5，6]，AST影響神經(jīng)元突觸可塑性及相關機制的研究在現(xiàn)代神經(jīng)科學研究中已成為關注的焦點[7～10]。本研究擬通過觀察大鼠在聽覺發(fā)育關鍵期聽性腦干反應(ABR)的變化特點及GFAP的表達變化，進一步探討星形膠質(zhì)細胞在聽皮層發(fā)育關鍵期可塑性中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選擇清潔級健康SD大鼠幼鼠50只，隨機分為出生后第14、21、28、35和42天組，每組10只。所有動物均在SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2ABR檢測方法 各組大鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，在隔聲屏蔽室內(nèi)用TDT電生理工作站(美國 TDT公司)發(fā)聲、放大、檢測、記錄click聲誘發(fā)的雙側ABR反應閾。記錄電極刺入頭顱矢狀縫與兩外耳道連線交點頭皮下, 參考電極放置在耳后皮下, 接地電極放置在大鼠鼻尖部皮下。交替短聲刺激, 聲源距外耳孔1.0 cm, 刺激間隔為0.1 ms, 濾波帶通為100～2 000 Hz, 掃描時間為10 ms, 強度范圍為20～110 dB SPL，疊加次數(shù)512 次, 以可以引出波Ⅲ的最小刺激強度為ABR反應閾。

1.3各組大鼠聽皮層腦組織切片 各組大鼠完成ABR測試后，分別在1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉下，開胸經(jīng)左心室插管至升主動脈，快速灌注生理鹽水沖洗至肝臟發(fā)白,然后用4%多聚甲醛灌注。固定30～40分鐘后即斷頭處死,去除顱蓋骨,取出腦組織塊,固定于4%多聚甲醛24小時。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜[11]對聽皮層進行定位，在通風櫥內(nèi)用手術刀截取聽皮層腦組織修平整并放脫水盒內(nèi)，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋制片。

1.4免疫組化染色檢測各組大鼠聽皮層GFAP表達 一抗為GFAP(兔抗)抗體(武漢谷歌生物科技有限公司，貨號GB13038)，二抗采用兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(DAKO，貨號K5007)。按兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒操作步驟進行免疫組化實驗(一抗按1∶100比例稀釋，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；二抗為組化試劑盒內(nèi)與一抗相應種屬，HRP標記，室溫孵育50 min)。

每組內(nèi)每張切片在皮層隨機挑選至少10個200倍視野進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野,保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus6.0軟件，選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析，得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD), 以每組所有照片的平均值代表該組的IOD值。

1.5Western blot分析各組大鼠聽皮層GFAP表達 各組每只大鼠取50 mg聽皮層組織，用冷TBS洗滌2～3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器，加入10倍組織體積RIPA buffer冰上徹底勻漿, 將勻漿液轉移至1.5 ml離心管中，振蕩。冰浴30 min，期間用移液器反復吹打，確保細胞完全裂解。12 000 rpm/min離心5 min，收集上清采用Bradford法測定蛋白濃度。

Western blot法檢測各組大鼠聽皮層GFAP的含量，在蛋白標本中加入上樣緩沖液后進行電泳，轉移至PVDF膜。將轉好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)封閉1 h，稀釋一抗，4 ℃過夜，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5 min，將二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫下孵育30 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5 min，將膜蛋白面朝上與發(fā)光液充分接觸，1～2 min后，去盡殘液，包好，放入暗匣中曝光，最后用顯影、定影試劑進行顯影和定影。將膠片進行掃描存檔，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值，以GFAP光密度值與對應內(nèi)參actin光密度值的比值表示蛋白表達水平。

1.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對各組實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗。

2 結果

2.1各組大鼠ABR反應閾比較 由表1可見，隨著大鼠天齡逐漸增加，其ABR反應閾逐漸下降，其中，第14、21及28天組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，第28天組與第35天組間差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而第35天組與第42天組ABR反應閾差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2各組大鼠聽皮層GFAP的表達比較 免疫組化染色結果顯示隨著大鼠出生后天齡逐漸增加，GFAP表達逐漸增強，其中第35天組與第42天組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余各組間兩兩相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)(表1、圖1)；Western blot檢測結果(圖2)顯示第14、21、28、35和42天組大鼠GFAP蛋白表達水平分別為1.00±0.06、3.07±0.07、4.92±0.05、6.88±0.03、8.92±0.04，各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

組別ABR反應閾(dB SPL)GFAP平均累積光密度值(IOD)第14天組 1 084.5±4.97474.36±234.56第21天組 1 070.5±3.69*1 465.93±474.96△△第28天組 1 058.5±5.80*2 163.06±353.36△△第35天組1 037.0±4.83** 6572.01±808.88△△第42天組1 035.5±3.697 244.37±932.90△

注：*與第14天組及組間比較，P<0.05；**與第28天組比較，P<0.01；△與第35天組比較，P<0.05；△△與第14天組及各組間比較，P<0.01

圖1 各組大鼠聽皮層GFAP表達(免疫組化染色×200)

a、b、c、d、e分別為第14、21、28、35和42天組大鼠聽皮層GFAP的表達，f為聽皮層GFAP陽性表達的星形膠質(zhì)細胞局部放大圖

圖2 Western blot檢測各組大鼠聽皮層GFAP蛋白表達水平

3 討論

研究證實,運動、視覺、嗅覺、體感及聽覺等系統(tǒng)的發(fā)育均存在關鍵期[12]，早期聲環(huán)境的改變可對大鼠聽覺的發(fā)育產(chǎn)生重要影響[13,14]。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多，分布最廣的膠質(zhì)細胞,不僅對神經(jīng)元具有絕緣、營養(yǎng)、保護和支持作用,而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復過程中也具有重要的作用[15，16]；諸多研究表明，膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中直接影響了突觸形成及其功能的完善；Prfieger等[17]發(fā)現(xiàn)，當把分離純化的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cells，RGCs)在無膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，RGCs形成的突觸雖然超微結構正常但自發(fā)性突觸活動較少，且在突觸傳遞中失敗率高；而與膠質(zhì)細胞共同培養(yǎng)的RGCs，其自發(fā)性突觸后電流的頻率和強度均顯著增加，而且極少出現(xiàn)傳遞失敗；進一步的研究表明，星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，無論其是否與RGCs直接接觸，都能明顯增加RGCs自發(fā)的興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)的平均頻率和強度；Ullian等[18]報道在有AST條件下培養(yǎng)的RGCs突觸總數(shù)是無AST培養(yǎng)的RGCs的7倍，此外，從培養(yǎng)基中移除AST后6天，RGCs的突觸數(shù)量減少至原來的l/4，同時突觸前、后對應分子的免疫反應性消失，表明AST不僅明顯增加突觸穩(wěn)定性，而且是維持突觸所必需的；譚來勛等[19]通過研究AST在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟過程中突觸可塑性的調(diào)控規(guī)律，發(fā)現(xiàn)AST在大鼠海馬神經(jīng)元突觸形成及其功能完善過程中可能發(fā)揮了重要作用。

GFAP作為星形膠質(zhì)細胞的中間絲和細胞骨架蛋白，被認為是反映星形膠質(zhì)細胞的可靠指標[20]，GFAP表達增多主要表現(xiàn)在星形膠質(zhì)細胞體積增大和數(shù)量增多，星形膠質(zhì)細胞可以通過這種體積和數(shù)量的變化來改變其與神經(jīng)元之間的生理聯(lián)系，進而影響突觸的可塑性，發(fā)揮其對神經(jīng)信息的調(diào)節(jié)作用[21]，促進聽覺中樞神經(jīng)網(wǎng)絡系統(tǒng)的的發(fā)育成熟及完善。從文中結果看，隨著出生后天齡的增加，大鼠ABR反應閾逐步下降，同時，其聽皮層GFAP表達逐漸增強，而且在其出生后第28～35天即大鼠聽覺發(fā)育關鍵期結束時，ABR反應閾下降與GFAP表達增強均有一個跨越。這種大鼠聽功能的不斷完善(ABR反應閾逐漸下降)與聽皮層GFAP表達增強相藕聯(lián)現(xiàn)象提示，在大鼠聽覺發(fā)育關鍵期，星形膠質(zhì)細胞可能參與其聽皮層的發(fā)育成熟過程，星形膠質(zhì)細胞可能通過數(shù)量的增多及功能的完善使大鼠的聽功能逐步發(fā)育完善，其具體機制有待進一步研究。

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