慢性噪聲暴露對大鼠聽皮層及海馬腦區(qū)胰島素樣生長因子-1表達(dá)的影響△

楊希林 廖華 陳抗松 解為全 楊琨 朱占永

長期噪聲暴露不僅對聽覺通路造成不良影響，也會增加機(jī)體其他系統(tǒng)尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷的風(fēng)險[1]。噪聲對人體的危害已經(jīng)成為社會普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，迫切需要在其病理生理機(jī)制及防治方面進(jìn)行深入研究。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是一種結(jié)構(gòu)和功能都類似胰島素的多肽類神經(jīng)營養(yǎng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育過程中和維持神經(jīng)系統(tǒng)的完整性及動態(tài)平衡方面具有重要而復(fù)雜的生物學(xué)作用[2]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的IGF-1可發(fā)揮非選擇性神經(jīng)保護(hù)作用，抑制細(xì)胞凋亡，有助于神經(jīng)細(xì)胞受損后的功能修復(fù)[3]。目前IGF-1在腦缺血缺氧損傷、阿爾茨海默癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中的臨床應(yīng)用價值越來越受到關(guān)注[4]，但其在噪聲暴露影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作用尚無系統(tǒng)性研究。因此，本研究擬通過檢測慢性噪聲暴露后大鼠聽皮層及海馬腦區(qū)IGF-1表達(dá)的變化，探討IGF-1在噪聲性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組及處理 選取ABR反應(yīng)閾正常且相近的Wistar成年雄性大鼠16只(由武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物中心提供)，隨機(jī)分為噪聲組和對照組，每組8只，對照組正常喂養(yǎng)，不予任何處理；噪聲組：將動物置于隔音混響室內(nèi)，參照Wibke等[5]的方法，給予中心頻率為4 kHz、聲強為100 dB SPL的寬帶白噪聲暴露，每天暴露4 h，持續(xù)28 d；噪聲由美國TDT(Tucker-Davis technology)公司 Rvpds軟件包編譯，連接揚聲器播放，并用聲級計校準(zhǔn)。

1.2實驗試劑及設(shè)備 兔抗大鼠IGF-1抗體、羊抗兔IgG(武漢博士德公司)；TDT系統(tǒng)(Tucker-Davis technology TDT公司，美國)。

1.3實驗方法

1.3.1ABR測試 于噪聲暴露前1 d、暴露第28 d，分別在隔聲屏蔽室內(nèi)對各組大鼠進(jìn)行ABR測試。按45 mg/kg的劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后置于固定架上，記錄電極插于大鼠左右耳連線中點顱頂皮下，參考電極插于給聲耳乳突皮下，接地線插于鼻尖，采用TDT系統(tǒng)SigGenRP軟件單耳給聲并采集信號，刺激聲為click，強度范圍為10～110 dB SPL，衰減間隔5 dB，濾波帶寬300～3 000 Hz，持續(xù)時間 10 ms，疊加1 024 次，以引出波Ⅲ的最小刺激強度為大鼠的反應(yīng)閾，波形分化較差時可以波Ⅲ幅值接近特定的電壓為判斷標(biāo)準(zhǔn)，記錄ABR的反應(yīng)閾值。

1.3.2大鼠聽皮層及海馬腦區(qū)組織標(biāo)本采集及免疫組織化學(xué)染色 噪聲暴露第28天，ABR檢測完畢后，將噪聲組和對照組大鼠經(jīng)1%戊巴比妥腹腔麻醉，開胸暴露心臟，灌注固定，依據(jù)大鼠立體定位圖譜定位大鼠海馬腦區(qū)及聽皮層，冰臺上斷頭取腦，迅速置于多聚甲醛溶液固定4 h以上，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。連續(xù)冠狀切片，厚度6 μm。每只大鼠海馬腦區(qū)及聽皮層腦區(qū)分別取4張切片行IGF-1免疫組織化學(xué)法染色。將切片置于3%H2O2室溫孵育10 min，檸檬酸緩沖液修復(fù)抗原，山羊血清封閉30 min后，用兔抗大鼠IGF-1抗體(1：50)4 ℃孵育過夜。充分洗滌后用生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗37 ℃孵育，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，孵育20 min，沖洗后DAB顯色，最后貼片、脫水、透明、封片。染色設(shè)PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察，胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性著色。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 運用Image Pro Plus 6.0(zpp60)圖像分析軟件分別計量分析兩組動物海馬及聽皮層標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色信號反應(yīng)產(chǎn)物的含量。每張腦片在400倍光鏡下隨機(jī)選取3個視野，計算每個視野中陽性細(xì)胞數(shù)及累積光密度值(integrated optical density, IOD)。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠實驗前后ABR反應(yīng)閾比較 噪聲暴露前，實驗組與對照組大鼠ABR閾值無明顯差異(P>0.05)。噪聲暴露第28天，與對照組比較，實驗組大鼠ABR反應(yīng)閾明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

表1 兩組大鼠實驗前后ABR反應(yīng)閾比較

注：*與對照組同期比較，P<0.01

2.2噪聲組和對照組大鼠海馬腦區(qū)與聽皮層神經(jīng)元IGF-1表達(dá)比較(圖1、2) 噪聲暴露28天后噪聲組大鼠海馬及聽皮層腦區(qū)均可見IGF-1免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元，其棕黃色染色顆粒位于胞漿中，與對照組比較，噪聲組大鼠海馬及聽皮層腦區(qū)IGF-1陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；且噪聲組大鼠海馬及聽皮層腦區(qū)IOD值均較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

圖1 噪聲暴露28天后IGF-1在兩組大鼠海馬腦區(qū)的表達(dá)(SP×400) a 噪聲組；b 對照組

組別只數(shù)(只)陽性神經(jīng)元數(shù)目(個/視野) 聽皮層 海馬 IOD值 聽皮層 海馬 噪聲組8856.52±6.89*144.28±19.19*4 192.03±246.44*13 613.39±1 959.51*對照組840.08±4.63108.44±9.822 344.48±554.856 890.58±1 344.99

注： *與對照組比較，P<0.01

3 討論

噪聲暴露所致聽覺系統(tǒng)損害主要包括暫時性或永久性閾移，以及伴隨的耳鳴等聽覺功能紊亂。聽覺傳導(dǎo)通路始于內(nèi)耳毛細(xì)胞，耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)的雙極細(xì)胞將外周聽覺信號向上依次經(jīng)過耳蝸核、外側(cè)丘系、下丘、內(nèi)側(cè)膝狀體至聽皮層，經(jīng)過復(fù)雜的分析綜合產(chǎn)生聽覺意識。既往關(guān)于噪聲對聽覺系統(tǒng)影響的研究重點主要集中于耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋等外周聽覺系統(tǒng)，隨著研究的深入，噪聲環(huán)境下聽覺中樞結(jié)構(gòu)和功能的變化越來越受到關(guān)注。已有動物實驗發(fā)現(xiàn)噪聲暴露后，小鼠耳蝸核及下丘中央核凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增多[6]，內(nèi)側(cè)膝狀體和聽皮層各區(qū)域細(xì)胞密度明顯下降[7]，包括聽皮層在內(nèi)的中樞聽覺通路各腦區(qū)谷氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、天門冬氨酸等氨基酸類遞質(zhì)表達(dá)較對照組顯著升高, 證明噪聲對聽覺中樞神經(jīng)信號傳遞有影響[8]。

由于聽覺通路與邊緣系統(tǒng)之間存在著廣泛聯(lián)系，長時間噪聲暴露后，邊緣系統(tǒng)也出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的變化。眾多流行病學(xué)調(diào)查顯示除了聽覺系統(tǒng)損害的表現(xiàn)之外，噪聲接觸者記憶力及學(xué)習(xí)能力減退、操作能力下降、厭煩反應(yīng)和消極社會行為等認(rèn)知功能改變發(fā)生率明顯增高，造成工作和學(xué)習(xí)效率及生活質(zhì)量的下降，這已經(jīng)成為備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。相對于流行病學(xué)研究而言，目前噪聲對認(rèn)知功能影響的深入實驗研究尚處于起步階段。海馬是與認(rèn)知功能關(guān)系最為密切的重要腦區(qū)，在陳述性學(xué)習(xí)記憶、整合認(rèn)知及情感信息中起著重要作用，也是相關(guān)研究的關(guān)鍵靶點。 Uran等[9]給予幼年大鼠中等強度噪聲暴露后(95～97 dB SPL,2 h)，發(fā)現(xiàn)其海馬區(qū)域結(jié)構(gòu)和功能改變，同時大鼠記憶、認(rèn)知等行為學(xué)表現(xiàn)異常；Cui等[10]給予大鼠持續(xù)14天的100 dB SPL白噪聲暴露后，發(fā)現(xiàn)大鼠海馬和前額葉均出現(xiàn)神經(jīng)退行性病變的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志tau蛋白磷酸化表達(dá)增高。因此，慢性噪聲暴露后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)重要功能腦區(qū)損傷的相關(guān)機(jī)制及修復(fù)是未來研究的熱點。

胰島素樣生長因子(IGF-1)是由70個氨基酸、3個二硫鍵交叉連接而成的單鏈堿性多肽分子，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其通過激活促分裂原活化蛋白激酶(mitoen-activatedprotein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(PI3K-Akt)等多條信號通路抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮非選擇性神經(jīng)保護(hù)作用，能夠在病理狀態(tài)下減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，有助于神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)。Cheng[11]給予蛋白酶抑制劑預(yù)處理的神經(jīng)元SH-SY5Y細(xì)胞系IGF-1后，發(fā)現(xiàn)凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)下降。Gleichmann等[12]觀察了IGF-1對小腦顆粒神經(jīng)元的抗凋亡作用，發(fā)現(xiàn)其與PI3K-Akt通路上促凋亡蛋白Bad的磷酸化有關(guān)。

本研究在給予大鼠100 dB SPL慢性噪聲暴露4周后，實驗組大鼠ABR反應(yīng)閾較對照組顯著升高，說明慢性噪聲暴露導(dǎo)致大鼠外周聽覺神經(jīng)至腦干通路的神經(jīng)電活動異常，聽功能出現(xiàn)損害，證明該慢性噪聲性聽損傷動物模型造模成功。文中結(jié)果顯示噪聲組聽覺通路高級中樞聽皮層及邊緣系統(tǒng)關(guān)鍵腦區(qū)海馬神經(jīng)元IGF-1表達(dá)均較對照組均顯著增加?？梢?，由于長期噪聲暴露可以導(dǎo)致聽覺通路高級中樞及其與情緒密切相關(guān)的邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的變化，甚至出現(xiàn)凋亡，因此推測，慢性噪聲暴露后，IGF-1系統(tǒng)被激活，其在相應(yīng)腦區(qū)的表達(dá)顯著增加，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用。目前，關(guān)于IGF-1在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用價值越來越受到關(guān)注。Maya-Vetencourt等[13]給予成年視覺剝奪動物模型皮層內(nèi)微泵灌注IGF-1共2周，發(fā)現(xiàn)外源性給予IGF-1可以增加成年動物神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性，并促進(jìn)視覺功能的恢復(fù)。 Dupraz等[14]分別給予離體培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)IGF-1受體(IGF-1R)拮抗劑、IGF1R序列小干擾RNA后，發(fā)現(xiàn)RGCs軸突再生顯著下降，說明成年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元軸突再生需要IGF-1R的激活。

本研究著眼于慢性噪聲暴露后大腦皮層聽覺中樞與情緒調(diào)節(jié)中樞邊緣系統(tǒng)IGF-1表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)長期噪聲暴露可導(dǎo)致聽覺中樞與邊緣系統(tǒng)IGF-1表達(dá)增加，可能與機(jī)體激活I(lǐng)GF-1系統(tǒng)發(fā)揮對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用有關(guān)，但其具體分子通路尚不明確。因此在下一步研究中，將著重探討內(nèi)源性IGF-1在噪聲性聽覺通路及邊緣系統(tǒng)損傷保護(hù)中的機(jī)制，并嘗試通過給予外源性IGF-1，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)噪聲性損傷起到修復(fù)作用，為減輕噪聲對人體的危害開辟新的治療途徑。

4 參考文獻(xiàn)

1 Ising H, Kruppa B. Health effects caused by noise: evidence in the literature from the past 25 years[J]. Noise Health, 2004, 6:5.

2 Bibollet-Bahena O, Cui QL, Almazan G. The insulin-like growth factor-1 axis and its potential as a therapeutic target in central nervous system (CNS) disorders[J]. Cent Nerv Syst Agents Med Chem, 2009, 9:95.

3 Fernandez AM, Torres-Aleman I. The many faces of insuin-like peptide signalling in the brain[J]. Nat Rev Neurosci, 2012,13:225.

4 Guan J, Mathai S, Liang H, et al. Insulin-like growth factor-1 and its derivatives: potential pharmaceutical application for treating neurological conditions[J]. Recent Pat CNS Drug Discov, 2013, 8:142.

5 Wibke S, Annalisa Z, Mirko J,et al.Noise-induced inner hair cell ribbon loss disturbs central arc mobilization: a novel molecular paradigm for understanding tinnitus[J]. Mol Neurobiol, 2013, 47:261.

6 Coordes A, Gr?schel M, Ernst A, et al. Apoptotic cascades in the central auditory pathway after noise exposure[J]. J Neurotrauma, 2012, 29:1 249.

7 Basta D, Tzschentke B, Ernst A.Noise-induced cell death in the mouse medial geniculate body and primary auditory cortex[J]. Neurosci Lett, 2005, 381: 199.

8 Godfrey DA, Kaltenbach JA, Chen K, et al. Amino acid concentrations in the hamster central auditory system and long-term effects of intense tone exposure[J]. J Neurosci Res, 2012, 90:2 214.

9 Uran SL, Aon-Bertolino ML, Caceres LG, et al. Rat hippocampal alterations could underlie behavioral abnormalities induced by exposure to moderate noise levels[J]. Brain Res, 2012, 1 471:1.

10 Cui B, Zhu L, She X, et al. Chronic noise exposure causes persistence of tau hyperphosphorylation and formation of NFT tau in the rat hippocampus and prefrontal cortex[J]. Exp Neurol, 2012, 238:122.

11 Cheng B, Maffi SK, Martinez AA, et al.Insulin-like growth factor-I mediates neuroprotection in proteasome inhibition-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells[J]. Mol Cell Neurosci, 2011, 47:181.

12 Gleichmann M, Weller M, Schulz JB.Insulin-like growth factor-1-mediated protection from neuronal apoptosis is linked tophosphorylation of the pro-apoptotic protein BAD but not to inhibition of cytochrome c translocation in rat cerebellar neurons[J]. Neurosci Lett, 2000, 282:69.

13 Maya-Vetencourt JF, Baroncelli L, Viegi A, et al. IGF-1 restores visual cortex plasticity in adult life by reducing local GABA levels[J]. Neural Plast, 2012. doi:10.1155/2012/250421.

14 Dupraz S, Grassi D, Karnas D, et al.The insulin-like growth factor 1 receptor is essential for axonal regeneration in adult central nervous system neurons[J]. PLoS One, 2013, 8:e54 462.