谷氨酸損傷體外培養(yǎng)大鼠螺旋神經(jīng)元中凋亡誘導(dǎo)因子的表達與分布*

丁忠家 唐曉旭 陳鑫 宋勇莉 米文娟 王劍 陳福權(quán) 邱建華

現(xiàn)階段細胞凋亡機制，主要以線粒體為中心，包括半胱氨酸天冬氨酸(caspase)途徑及caspase非依賴途徑。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor，AIF)在caspase非依賴途徑的細胞凋亡中起關(guān)鍵作用[1]。AIF 凋亡途徑是一種caspase非依賴凋亡途徑，也是現(xiàn)階段以線粒體為中心的細胞凋亡中的重要途徑[2]，多發(fā)生于神經(jīng)細胞、特殊類型腫瘤細胞等[3]。AIF作為氧化傳遞鏈中一種重要的黃素蛋白，廣泛分布于線粒體內(nèi)膜，成為AIF途徑凋亡的發(fā)生基礎(chǔ)[4]。

螺旋神經(jīng)元細胞(spiral garglion neurons，SGNs)是耳蝸中重要的感覺細胞，在聲信號轉(zhuǎn)換及傳導(dǎo)中起重要作用。螺旋神經(jīng)元的損傷、凋亡，可以直接引起聽力減退，內(nèi)毛細胞向聽覺中樞信號傳遞障礙，甚至可能導(dǎo)致聽神經(jīng)病的發(fā)生[5]。螺旋神經(jīng)元損傷、凋亡過程中，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glu)發(fā)揮著重要作用，是噪聲性聾、年齡相關(guān)性聾、部分難治性聾等感音神經(jīng)性聾的重要病因[6]。然而，谷氨酸毒性損傷是否與AIF凋亡因子相關(guān)以及是否參與耳聾的發(fā)生，仍有待進一步研究。本實驗采用體外培養(yǎng)螺旋神經(jīng)元的方法，觀察不同濃度谷氨酸損傷條件下，螺旋神經(jīng)元中AIF的表達與分布狀況，探討谷氨酸促螺旋神經(jīng)元凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選用40只出生后0～3天SD大鼠螺旋神經(jīng)元行體外培養(yǎng)，動物由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，平均分為4組，分別為正常組：僅給予正常SGNs培養(yǎng)液培養(yǎng)；10 mM Glu組：按1:7分別加入80 mM谷氨酸液及SGNs培養(yǎng)液培養(yǎng)；20 mM Glu組：按1:3分別加入80 mM谷氨酸液及SGNs培養(yǎng)液培養(yǎng)；40 mM Glu組：按1:1分別加入80 mM谷氨酸液及SGNs培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) SD大鼠仔鼠以75%酒精消毒后，斷頭，頭顱矢狀位正中斷開后去除周圍組織，取出耳蝸，置于消毒超凈臺中，挑開聽泡，去除血管紋、螺旋韌帶，沿基底膜底撕除基底膜，保留螺氏管和中軸放置于培養(yǎng)液中，機械法裂解組織后，加入0.125%胰蛋白酶和0.125%膠原酶酶解組織，37 ℃條件下孵育30 min，玻璃管吹打組織，待2次Hanks液漂洗離心后，濾過膜過濾，加入細胞培養(yǎng)液4 ml，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育，培養(yǎng)1天，第2天換液，加入Glu液和細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時后于倒置顯微鏡下觀察。

1.2.2螺旋神經(jīng)元細胞的免疫熒光染色 培養(yǎng)48 h后細胞加4% 多聚甲醛固定30 min，0.1 M PBS漂洗3次，每次5 min；后加入0.3% TritonX-100打孔，常溫下放置15 min，0.1 M PBS漂洗；加5%牛血清封閉，37 ℃孵育20 min；甩凈液體后，標本滴加稀釋后一抗(如1:100稀釋后的AIF溶液或1:200稀釋后的tublin溶液)，4 ℃冰箱中靜置3天，0.1 M PBS漂洗；再于黑暗環(huán)境中滴加稀釋后熒光二抗，4 ℃孵育1天，0.1 M PBS漂洗；1:1 000稀釋的DAPI液襯核，常溫下孵育10 min，0.1 M PBS漂洗，去除多余液體，滴加100 μl 85%甘油，封片，于熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.3實時熒光定量PCR

1.2.3.1RNA提取 向培養(yǎng)48 h后的細胞中加300 μl RLTbuffer，勻漿，最大速度離心3 min，取上清液，加入300 μl 70%酒精，混勻；移至RNeasy Mini spin，8 000 r/min離心15 s；向RNeasy Mini spin加700 μl RWI buffer，8 000 r/min離心15 s；再次加入500 μl RPE buffer，8 000 r/min離心15 s，棄廢液；重復(fù)上步驟，離心2 min；將RNeasy Mini spin置于新管中，全速離心1 min，加入30 μl Rnase free水，8 000 r/min離心2 min；將收集到液體重新加入離心柱重復(fù)離心，可提供RNA濃度。

1.2.3.2cDNA逆轉(zhuǎn)錄 步驟按QIAGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟，配制模板體系(14 μl)，42 ℃孵育2 min，置于冰上，再配制逆轉(zhuǎn)錄體系(20 μl)，42 ℃孵育30 min，95 ℃孵育3 min得cDNA，于-20 ℃保存。cDNA反應(yīng) 按QIAGEN反應(yīng)試劑盒步驟，配制反應(yīng)體系，上機反應(yīng)。管家基因(GAPDH)引物序列：R-GAPDH-F: TAGAACTCCAGATGGCAAGACA；R-GAPDH-R: CGCCAGTAGA CTCCACGACA；目的基因引物序列：R-AIF-F:TAGAACTCCAGATGGCAAGACA,R-AIF-R:AAGCCCACAATAAGGACTAACAC;R-caspase3-F:GAATGACTGGGAGTGGGGTAG,R-caspase3-R:GACCTGGAACATCGGATTTGA;R-calpgin-F:AAGCCCACAATAAGGACTAACAC,R-calpain-R: TAAGGGCGTCAGGTGTAAGGT。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 實驗中的數(shù)據(jù)均為計量資料，故用均數(shù)±標準差來表示，運用SPSS17.0 和Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及圖表繪制，組間兩兩比較采用單因素方差分析SNK-q 檢驗,α=0.05。

2 結(jié)果

2.1不同濃度Glu組SGNs的形態(tài) 體外培養(yǎng)SGNs 48 h后，光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)正常組細胞胞體呈梭形，周圍可見光暈，雙極伸出較長突起，細胞狀態(tài)良好；10 mM Glu組神經(jīng)元形態(tài)明顯，雙極突起延長，與正常組形態(tài)無明顯變化；20 mM Glu組SGNs細胞軸突縮短明顯，胞體可見透光點，SGNs形態(tài)變化明顯；40 mM Glu組軸突消失，胞體皺縮，胞漿中透光明顯，可見明顯細胞損傷(圖1)。

圖1 體外培養(yǎng)48 h后各組螺旋神經(jīng)元細胞形態(tài)圖(×100)

a～d分別為正常組、10 mM Glu組、20 mM Glu組及40mM Glu組SGNs倒置顯微鏡下細胞形態(tài)，白色箭頭示典型SGN細胞

圖2 各組螺旋神經(jīng)元TUNEL免疫熒光染色圖(×600) 四組TUNEL染色細胞核，紅色為TUNEL染色，藍色為DAPI染色

圖3 各組AIF免疫熒光分布圖(×1 000)

Glu干預(yù)后的體外培養(yǎng)SGNs細胞行免疫熒光染色，AIF襯染為紅色，DAPI襯核。白色箭頭示AIF分布異常的SGNs細胞。a～d分別為正常組、10 mM Glu組、20 mM Glu組及40mM Glu組

2.2不同濃度Glu組SGNS TUNEL染色結(jié)果 熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組中SGNS細胞核呈橢圓形，核質(zhì)均勻，而TUNEL著色細胞核幾乎不可見；10 mM Glu組胞核固縮明顯，但TUNEL著色細胞核仍較少：20 mM Glu組可見明顯細胞核固縮及明顯的TUNEL著色；40 mM Glu組TUNEL著色細胞核進一步增加，細胞凋亡明顯(圖2)。

2.3免疫熒光觀察AIF在SGNs中分布變化 正常組AIF均勻著色于胞漿及軸突，與細胞核界限分明，可見明顯雙極突起及胞漿著色；10 mM Glu組紅色AIF開始與藍色細胞核重疊，但核轉(zhuǎn)位不明顯；20 mM Glu組AIF不僅分布于雙極軸突及胞漿，胞核也可見明顯著色；40 mM Glu組螺旋神經(jīng)元胞體皺縮，雙極形態(tài)不可見， AIF在胞核分布明顯(圖3)。同一視野計數(shù)AIF分布于細胞核的細胞比率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組未見AIF轉(zhuǎn)位細胞，10 mM Glu、20 mM Glu和40 mM Glu組核轉(zhuǎn)位細胞率分別為11.1%±4.8%、15.1%±1.4%和50.0%±5.6%，與正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨谷氨酸濃度升高，AIF轉(zhuǎn)位細胞數(shù)目增加。

2.4各組SGNs中AIF、calpain和caspase 3的表達變化 PCR結(jié)果顯示，不同濃度Glu組AIF mRNA表達水平明顯高于正常組(P<0.05)，從低濃度到高濃度Glu組，AIF mRNA表達水平呈下降趨勢；Calpain mRNA表達水平在正常及10 mM Glu組之間無明顯差異，在20 mM Glu組和40 mM Glu組中表達明顯升高(P<0.05)。各組間caspase 3 mRNA表達水平無明顯差異(P>0.05)，但隨Glu濃度增加其表達量呈下降趨勢(表1)。

表1 各組體外培養(yǎng)SGNs中AIF、calpain及caspase 3相對表達量

注：*與其他組相比，P<0.05

3 討論

研究表明，噪聲、缺血、缺氧、耳毒性藥物等都可導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾，而谷氨酸(Glu)興奮性毒性在其中發(fā)揮著重要作用。Glu興奮性毒性可導(dǎo)致神經(jīng)元長時程或短時程突觸信號傳導(dǎo)障礙[7]，可影響神經(jīng)元的正常傳輸信號，從而引起神經(jīng)元細胞的退行性病變或凋亡，這是螺旋神經(jīng)元損傷的生理機制之一。在損傷條件下，興奮性Glu可由毛細胞過多釋放入突觸間隙，與螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi)的SGNs細胞表面Glu受體結(jié)合，激活下游途徑，導(dǎo)致氧化損傷或鈣超載的發(fā)生，從而誘導(dǎo)SGNs的退行性病變或凋亡，導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾。而氧化損傷或鈣超載，均可激活體內(nèi)一系列損傷凋亡途徑，與線粒體為中心的calpain-AIF途徑相關(guān)[8]。本研究結(jié)果顯示不同濃度Glu干預(yù)體外培養(yǎng)SGNs 48 h后，20 mM濃度谷氨酸即可誘導(dǎo)SGNs軸突縮短，胞體出現(xiàn)透亮光點；TUNEL凋亡染色結(jié)果提示隨Glu濃度升高，細胞核固縮及細胞凋亡現(xiàn)象越來越明顯，這與Steinbach等[9]發(fā)現(xiàn)高濃度Glu對SGNs有損傷作用一致。

耳蝸感覺細胞的損傷凋亡與caspase 3途徑有一定相關(guān)性。Schmutzhard等[10]研究認為敗血癥引起重度聽力損失的過程中，Corti器支持細胞caspase途徑被激活，影響毛細胞的再生與修復(fù)；Abaamrane等[11]研究顯示爆震性損傷中，caspase凋亡途徑導(dǎo)致毛細胞減少，從而引起聽力損傷發(fā)生；Steinbach等[9]應(yīng)用caspase阻斷劑z-VAD-FMK[z-Val-Ala-Asp(ome)-fluoromethy-lketone]可有效抑制SGNs軸突的縮短。但是單純阻斷caspase途徑并不能有效抑制耳蝸感覺細胞損傷凋亡，說明耳蝸感覺細胞凋亡過程中可能存在其他凋亡途徑，如：AIF凋亡途徑，因此本研究探討AIF途徑在Glu損傷耳蝸感覺細胞中的作用。

AIF是正常線粒體中的一種黃素蛋白，存在于線粒體內(nèi)膜上，在氧化傳遞鏈中有重要作用。AIF由三部分構(gòu)成，包括黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinudeotide,FAD)結(jié)合序列、2個核定位序列及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinanide adenine dinudeotide,NAD)定位序列組成，生理狀況下，N端通過特定線粒體定植序列(mitochondrial leading sequence,MLS)序列插入到線粒體內(nèi)膜中[12]。目前認為，AIF凋亡途徑是在凋亡信號誘導(dǎo)下，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進鈣離子濃度升高，激活calpain蛋白，剪切定位于內(nèi)膜的AIF，并通過線粒體傳輸孔道(pereabitily transition pore,PTP)孔釋放AIF到胞漿[13]，AIF自胞漿轉(zhuǎn)運至胞核可與限制性內(nèi)切酶EndG等結(jié)合，裂解DNA分子成片段，促進細胞凋亡發(fā)生[14]。在皮層神經(jīng)元培養(yǎng)的實驗中，DNA修復(fù)酶(ploy ADP-ribose polymerase,PAPR-1)介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)毒性，可誘導(dǎo)AIF進入細胞核[8]；給予SD大鼠130 dB SPL的白噪聲2 h后，在基底膜染色鋪片發(fā)現(xiàn)AIF核轉(zhuǎn)位，且隨AIF表達的上調(diào)，EndG表達亦上調(diào)，促進外毛細胞的凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸損傷SGNs作用過程中，有明顯核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象，而RT-PCR也發(fā)現(xiàn)不同濃度Glu組AIF mRNA表達水平明顯高于正常組，說明AIF在Glu損傷SGNs的過程中有重要作用。而caspase 3在免疫熒光染色中未顯色，各組mRNA表達水平也無差異，從而說明Glu損傷體外培養(yǎng)SGN過程中不存在caspase途徑。

Calpain蛋白屬于鈣依賴蛋白家族，為非溶酶體性半胱氨酸蛋白酶，廣泛存在于哺乳動物及其他物種中[16]，主要分布于胞漿，可被Ca2+激活，具有重要蛋白水解作用。有作者認為，calpain是AIF途徑上游的主要作用蛋白，其被激活后，可通過線粒體外膜，剪切定位于內(nèi)膜的AIF，并通過線粒體PTP孔釋放AIF到胞漿[13]。本研究PCR結(jié)果顯示高濃度谷氨酸組的calpain表達明顯升高，提示螺旋神經(jīng)元損傷過程中存在上述過程，說明calpain與AIF協(xié)同參與了谷氨酸對體外培養(yǎng)SGN的損傷凋亡，而AIF在細胞核的分布，也進一步驗證了calpain-AIF途徑主導(dǎo)SGNs的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，Glu損傷體外培養(yǎng)的SGNs與calpain-AIF凋亡途徑相關(guān)，而非caspase途徑；提示可否通過抑制calpain抑制AIF途徑，達到減少螺旋神經(jīng)元凋亡、從而恢復(fù)聽力的目的，為耳聾的防治提供了新的研究方向。

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