難治性突發(fā)性聾患者外周血單個核細(xì)胞內(nèi)HDAC2表達(dá)與其預(yù)后的相關(guān)性分析*

后婕 戴艷紅 謝利生 周瓊瓊 佘萬東

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)用于治療突發(fā)性聾(sudden sensorineural hearing loss,SSNHL)，抑制各種因素導(dǎo)致的內(nèi)耳炎癥反應(yīng), 其療效已經(jīng)得到公認(rèn)[1,2]，但是全身給藥的有效率介于35%～89%之間[3～5]，極重度以上SSNHL的患者預(yù)后更差[4]，目前鼓室局部灌注GC治療難治性SSNHL的有效率也僅為20%～61.9%[6～9]。研究顯示[10,11]，最終聽力恢復(fù)較好的患者，在GC治療的早期聽力即有改善,提示部分SSNHL患者對GC治療可能存在不敏感或抵抗。炎性疾病的GC抵抗與多種因素有關(guān)[12], 李春林等[13]認(rèn)為SSNHL患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中糖皮質(zhì)激素受體β(glucocorticoid receptor-β,GRβ)表達(dá)水平的異常與其GC療效密切相關(guān)，而本研究的前期研究未發(fā)現(xiàn)SSNHL患者的聽力恢復(fù)與其PBMC中GRα、GRβmRNA水平變化有關(guān)[14]。GC在體內(nèi)主要通過增加抗炎基因的轉(zhuǎn)錄以及減少炎癥基因的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮抗炎效應(yīng)[15]。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；芄δ芟嗷マ卓沟膬山M酶即組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyl transferase,HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)所調(diào)節(jié)。HAT使組蛋白乙?；? 纏繞其上的染色質(zhì)由關(guān)閉狀態(tài)變?yōu)殚_放狀態(tài), 有利于RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子與其上的轉(zhuǎn)錄位點相結(jié)合, 進(jìn)而增強炎癥基因的轉(zhuǎn)錄與炎癥蛋白的表達(dá)。而HDAC2可以逆轉(zhuǎn)這一過程, 同時它還可以和多種轉(zhuǎn)錄因子如核因子κB(NFκB) 以及激活蛋白-1(AP-1) 相互作用, 導(dǎo)致炎癥基因轉(zhuǎn)錄抑制, 進(jìn)而使炎癥基因編碼的炎癥因子表達(dá)減少。HDACs家族分為Ⅳ類，HDAC2屬于I類[16]，它廣泛表達(dá)且主要位于細(xì)胞核內(nèi), 與基因的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。本研究以經(jīng)過常規(guī)治療無效后采用鼓室內(nèi)灌注GC的SSNHL患者為研究對象，檢測其PBMC中HDAC2的表達(dá)，探討HDAC2水平與其療效之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象及納入標(biāo)準(zhǔn) 研究對象為2013年1月至2013年9月于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院收治的難治性突發(fā)性聾患者，共20例20耳，其中男12例，女8例，年齡18～64歲，平均45.5 ± 14.9歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)分會制定的突發(fā)性聾診斷標(biāo)準(zhǔn)[17]，無感音神經(jīng)性聾家族史；②已接受10天以上的常規(guī)治療(包括全身使用GC、改善微循環(huán)、營養(yǎng)神經(jīng))無效(其中4例曾接受高壓氧治療)，患耳0.5～4 kHz平均聽閾(pure tone average, PTA) 依然>60 dB HL。排除中途退出研究或失訪者。治療結(jié)束后隨訪至發(fā)病三個月后，按照受損頻率PTA改善是否 ≥ 15 dB分為GC有效組和GC無效組。發(fā)病至接受此次治療的時間為10～42天,平均17.7±9.32天，治療前PTA(0.25～8 kHz)平均為78.67±11.62 dB HL，GC有效組和GC無效組PTA分別為75.21±9.44和80.98±12.73 dB HL，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(t=1.092，P=0.289)。按照我國突發(fā)性聾多中心臨床研究的分型的標(biāo)準(zhǔn)[18]，20例患者中聽力曲線呈平坦型9例，全聾型11例。取同期住院治療的雙耳聽力正常、無其他內(nèi)科疾病及慢性鼻炎過敏性鼻炎等慢性炎癥疾病的單純鼻中隔偏曲志愿者10例作為對照組。

1.2治療方法 突聾患者于入院第二天早晨抽取空腹外周血分離PBMC以進(jìn)行后續(xù)檢驗，進(jìn)行純音聽閾檢測后次日患耳鼓室置管[9]，每天鼓室灌注甲強龍20 mg，并予銀杏葉提取物注射液105 mg、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉40 mg靜脈滴注，每天一次，連續(xù)10天。治療結(jié)束后再次提取PBMC，復(fù)查純音聽閾，出院后繼續(xù)隨訪觀察鼓膜生長及聽力改善情況。對照組手術(shù)前采集空腹血分離PBMC。本研究獲得南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院醫(yī)學(xué)臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，并征得患者知情同意，簽定同意書。

1.3PBMC中HDAC2表達(dá)檢測

1.3.1PBMC提取 采集清晨空腹血20 ml，等體積生理鹽水稀釋后，加入到淋巴細(xì)胞分離液(天津灝陽)中，密度梯度離心，收集PBMC，洗滌后，凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.2PBMC中HDAC2蛋白活性檢測

1.3.2.1提取核蛋白 使用碧云天公司的細(xì)胞核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒，按照說明書操作，提取核蛋白，所得核蛋白保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2.2HDAC2蛋白活性檢測 用碧云天公司的BCA蛋白濃度檢測試劑盒，檢測核蛋白濃度，按照Epiquik HDAC2 Assay Kit說明書要求將核蛋白稀釋至0.4～1.0 μg/μl 之間，實驗將核蛋白濃度稀釋至0.8 μg/μl。隨后經(jīng)過孵育、洗板、加入顯色抗體、反應(yīng)液以及終止液等過程，最后用450 nm波長檢測，讀取每孔OD值，用OD值間接反映HDAC2蛋白活性。

1.3.3HDAC2 mRNA表達(dá)的檢測

1.3.3.1細(xì)胞總RNA的提取 用Invitrogen公司的trizol裂解PBMC，離心，小心吸取上層無色水相，用異丙醇沉淀RNA，棄上清，75%乙醇洗滌沉淀，簡單干燥RNA，最后將提取的RNA溶解于DEPC水中，-80 ℃冰箱保存。使用前用紫外分光光度計測定其濃度和純度。

1.3.3.2RT-PCR檢測HDAC2 mRNA的表達(dá)

①引物：RT-PCR HDAC2引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，GAPDH引物購自TAKARA公司，各引物序列見表1：

表1 RT- PCR引物序列

②cDNA合成：按照TAKARA公司試劑盒PrimeScript RT Master Mix說明書操作，以5 μl總RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

③Real Time PCR 按SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)說明書配置體系，進(jìn)行擴增，以GAPDH作為內(nèi)參，對HDAC2 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行相對定量，PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)定為95 ℃預(yù)變性30秒，95 ℃變性5秒，60℃退火/延伸34秒，循環(huán)40次，擴增反應(yīng)結(jié)束后, 立即進(jìn)行融解曲線分析, 判定是否有非特異性擴增產(chǎn)物的存在。分別計算GR及GAPDH基因的Ct值, 兩者之差即為△Ct值，2-△Ct即作為評價HDAC2 mRNA相對表達(dá)水平的指標(biāo)。 采用7500 system SDS software 分析所得結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1突聾組治療效果 本組20例突聾患者治療后PTA為63.09±22.59 dB HL，與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.005，P=0.007)，其中，GC有效8例，GC無效12例，GC有效組與無效組治療后PTA分別為40.83±14.37和77.92±12.25 dB HL，GC有效組治療后聽力較治療前明顯提高(t=4.526，P=0.003)(表2)。

表2 GC有效組及GC無效組治療前后 PTA比較

2.2三組HDAC2蛋白活性及HDAC2 mRNA表達(dá)量 此次治療前，GC有效組以及GC無效組的HDAC2蛋白活性均顯著低于對照組(F=13.291，P<0.05)，而HDAC2 mRNA表達(dá)量顯著高于對照組(F=6.047，P<0.05)(表3)。

治療后，GC無效組HDAC2蛋白活性與治療前無明顯變化(t=0.937，P>0.05)(表3)，而GC有效組HDAC2蛋白活性較治療前明顯提高(t=6.148，P<0.01)(表3)，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.287，P=0.778)。GC有效組與GC無效組HDAC2 mRNA表達(dá)均較治療前提高(均P<0.01)。

表3 各組HCAC2蛋白活性和HDAC2 mRNA的表達(dá)比較

注：與GC無效組治療前相比，*P<0.05；與GC有效組治療前相比，△P<0.01

3 討論

難治性突發(fā)性聾(refractory sudden sensorineural hearing loss)目前沒有明確的定義，國外一般認(rèn)為經(jīng)過10～14天常規(guī)治療無效的患者，即為難治性突發(fā)性聾[2,6,9]。本研究入選病例選擇常規(guī)治療十天以上無效(包括激素、改善血液循環(huán)藥、營養(yǎng)神經(jīng)劑)、0.5～ 4 kHz PTA 仍然>60 dB HL的患者。此類患者聽力差，一般不易自愈[2]，較易接受鼓室置管灌注激素這種有創(chuàng)的治療方案。

在SSNHL的治療中，GC因可抑制不同病因引起的內(nèi)耳炎癥反應(yīng)、改善微循環(huán)、維持內(nèi)外淋巴液的離子平衡，是目前公認(rèn)的治療SSNHL的一線藥物[1,2 ]，全身或鼓室局部給予GC后，GC與胞漿內(nèi)GRα結(jié)合轉(zhuǎn)運到核內(nèi)，一方面與GRE結(jié)合，激活抗炎基因的轉(zhuǎn)錄；另一方面激活的GRα通過募集HDAC2至炎癥基因的啟動子區(qū)域，抑制NFκB相關(guān)的組蛋白乙?；痆15]，抑制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。HDAC2的水平會由于翻譯后修飾，如硝化或氧化作用而發(fā)生下調(diào)，可導(dǎo)致部分炎性疾病如哮喘患者GC抵抗，HDAC2超表達(dá)可以恢復(fù)GC抵抗患者對GC的敏感性[19]。SSNHL的發(fā)病與氧化應(yīng)激[20,21]、炎性反應(yīng)[22]密切相關(guān)，氧化應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)存在，能明顯降低HDAC酶的活性，使組蛋白乙酰化/去乙?；胶獗淮蚱?，組蛋白分子過乙?；⒀装Y蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和炎癥蛋白的合成得到加強，阻斷了GC的抗炎癥反應(yīng)效應(yīng)[23,24]。目前在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)以及過敏性哮喘等的治療領(lǐng)域?qū)τ贖DAC2與GC抵抗研究較多，而在SSNHL的發(fā)病及治療中的作用，研究尚不深入。本研究對GC有效組、GC無效組以及對照組PBMC中HDAC2的蛋白活性以及mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常規(guī)治療(包括GC)無效的SSNHL患者，其體內(nèi)HDAC2蛋白活性顯著降低，與其他有關(guān)GC抵抗的炎癥疾病的研究結(jié)果一致[25]，提示SSNHL患者體內(nèi)可能存在氧化應(yīng)激反應(yīng)[20,21]。鼓室灌注GC治療促進(jìn)了GC有效組患者的PBMC中HDAC2蛋白活性提高，間接反映內(nèi)耳組織HDAC2蛋白活性的提高[26]，恢復(fù)機體或內(nèi)耳對GC的敏感性，有助于患者的聽力恢復(fù)；全身應(yīng)用銀杏提取物，具有清除自由基作用[27]，也可能提高HDAC2蛋白活性。但本次治療后依然無效(即GC無效組)患者HDAC2蛋白活性依然低于對照組，說明GC可以上調(diào)HDAC2基因的表達(dá)，但在蛋白的修飾過程中，GC無效患者體內(nèi)的HDAC2被氧化或硝化，蛋白含量或活性降低[19]。GC治療后HDAC2 mRNA表達(dá)量進(jìn)一步升高，推測原因是，本組均為入院前已接受10天或以上的常規(guī)治療無效的患者，他們此前接受的GC全身治療可能由于某些因素[24]不足以抑制患者體內(nèi)的炎癥狀態(tài)，僅能上調(diào)HDAC2 mRNA的表達(dá)，并不能提高HDAC2蛋白活性，在接受鼓室灌注甲強龍及靜脈給予銀杏葉提取物后，GC有效組患者體內(nèi)對HDAC2翻譯后修飾的過程被抑制，使得HDAC2蛋白活性提高，聽力改善。而經(jīng)過本次治療后依然無效的患者體內(nèi)可能存在某種與COPD患者GC抵抗相似或相同的機制[25]，HDAC2翻譯后修飾并不能被GC抑制，有待于進(jìn)一步探索。

綜上，SSNHL患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等可使HDAC2活性下降，給予GC鼓室內(nèi)灌注治療后，SSNHL患者PBMC內(nèi)的HDAC2 mRNA表達(dá)和HDAC2蛋白活性上調(diào)，說明GC能有效抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，有助于聽力恢復(fù)；而聽力不能恢復(fù)者則可能與HDAC2蛋白活性下降有關(guān)。由于對SSNHL患者GC無效的影響因素很多，在將來的實驗中，需要增加樣本量，更深入研究，探討影響HDAC2下降的機理，指導(dǎo)SSNHL的治療。

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