轉(zhuǎn)基因水稻基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物真實(shí)性的鑒定技術(shù)研究

余笑波， 應(yīng) 榮， 俞曉平， 崔海峰， 王 晶，隋志偉， 李 亮， 臧 超， 葉子弘

（1.中國(guó)計(jì)量學(xué)院，浙江杭州 310018； 2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029）

轉(zhuǎn)基因水稻基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物真實(shí)性的鑒定技術(shù)研究

余笑波1， 應(yīng) 榮1， 俞曉平1， 崔海峰1， 王 晶2，隋志偉2， 李 亮2， 臧 超2， 葉子弘1

（1.中國(guó)計(jì)量學(xué)院，浙江杭州 310018； 2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029）

以PCR技術(shù)及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)為基礎(chǔ)，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號(hào)和陰性受體秀水11進(jìn)行真實(shí)性鑒定。利用典型性檢測(cè)、指紋圖譜技術(shù)對(duì)候選物的轉(zhuǎn)基因事件的真實(shí)性、轉(zhuǎn)入事件正確性（是否為特異性目標(biāo)外源基因）、品系遺傳背景進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，克螟稻2號(hào)只含特異性序列Cry1Ab，秀水11不含所選的外源基因，它們具有相同的遺傳背景。隨機(jī)各抽取克螟稻2號(hào)和秀水11水稻100株，通過(guò)特異性PCR、免疫印跡實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)原材料的純度，結(jié)果表明，克螟稻2號(hào)為100%的轉(zhuǎn)基因水稻，秀水11為100%的陰性受體水稻。

計(jì)量學(xué)；轉(zhuǎn)基因水稻；基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；品系鑒定；純度鑒定；指紋圖譜技術(shù)

1 前 言

隨著轉(zhuǎn)基因作物及制品的推廣，其安全性問(wèn)題已逐漸引起人們的關(guān)注。越來(lái)越多的國(guó)家建立相關(guān)的技術(shù)體系和相關(guān)制度對(duì)轉(zhuǎn)基因的安全性進(jìn)行評(píng)估，設(shè)立了轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的最低含量閾值。在此背景下，轉(zhuǎn)基因水稻、玉米等［1，2］標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)運(yùn)而生，并且越來(lái)越重要。

原材料的鑒定是轉(zhuǎn)基因基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的基礎(chǔ)。首先標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身要求原材料具有溯源性，包括原材料的來(lái)源和品質(zhì)是否符合真實(shí)性的要求。其次盡可能詳細(xì)地了解原材料的背景有利于后期建立較好的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備體系。近年來(lái)，以微衛(wèi)星標(biāo)記為基礎(chǔ)的水稻DNA指紋圖譜構(gòu)建逐漸展開(kāi)［3，4］，越來(lái)越多的不同品種的水稻被重新整理和歸類。對(duì)比轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原材料真實(shí)性鑒定的要求，種子資源品系鑒定技術(shù)只解決了轉(zhuǎn)基因背景材料的品系真實(shí)性問(wèn)題，并沒(méi)有在轉(zhuǎn)基因作物外源基因真實(shí)性和背景材料純度上進(jìn)行鑒定。

本研究針對(duì)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原材料真實(shí)性鑒定的要求提出鑒定技術(shù)方案，以克螟稻2號(hào)和陰性受體秀水11［5］為研究對(duì)象，從轉(zhuǎn)基因事件的真實(shí)性、轉(zhuǎn)入事件正確性（是否為特異性目標(biāo)外源基因）、品系遺傳背景及原材料的純度等方面進(jìn)行了鑒定研究。

2 材料與方法

2.1 水稻材料

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻克螟稻2號(hào)由浙江大學(xué)提供，轉(zhuǎn)基因受體親本秀水11由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，其余18個(gè)粳稻品種由中國(guó)水稻研究所和浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。20個(gè)粳稻依次分別為：測(cè)21，湘虎25，秀水11，克螟稻2號(hào)，浙粳37，嘉禾218，春江03，臺(tái)202，桂花黃，甬粳18，浙糯5號(hào)，秀水110，原粳35，秀水129，南粳41，秀水220，嘉花1號(hào)，浙粳22，秀水63，早單八。

2.2 方法

2.2.1 轉(zhuǎn)化事件的真實(shí)性鑒定

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因克螟稻2號(hào)插入的外源基因只有Cry1Ab且未受其他轉(zhuǎn)基因材料的污染，本文選取國(guó)內(nèi)外具有代表性的抗蟲(chóng)水稻，包括我國(guó)繁育的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻KMD1（Cry1Ab）［6］、TT51-1（Bt融合型殺蟲(chóng)蛋白基因Cry1Ac／Cry1Ab）［7］和科豐6號(hào)（Cry1Ac＋CpTI）［8］，抗除草劑的水稻LLRICE62（Bar）和LLRICE601（Bar）［9］，選用根據(jù)邊界序列設(shè)計(jì)的品系特異性引物，克螟稻2號(hào)（KMD2）為基因特異性引物（委托Takara公司，根據(jù)插入的外源基因Cry1Ab序列設(shè)計(jì)）。

以秀水11和克螟稻2號(hào)的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR（Veriti96 well Thermal Cycler，Applied Biosystems）擴(kuò)增，其PCR反應(yīng)條件參考各自引用的文獻(xiàn)來(lái)確定。PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠下電泳（DYY-6D型，北京市六一儀器廠），結(jié)果在凝膠成像儀（212PRO，Carestream）中檢測(cè)。表1為6種外源引物和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因引物SPS［10］信息。

表1 SPS引物和6種外源引物

2.2.2 品系鑒定

為了建立秀水11及其轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號(hào)和其他18種粳稻的品系指紋圖譜，選取GB／T 20396—2006［11］上推薦的48對(duì)隨機(jī)簡(jiǎn)并引物和程保山等［12］所推薦的46對(duì)隨機(jī)簡(jiǎn)并引物。供使材料的種子在25℃下浸泡24 h，保持水分，30℃培養(yǎng)7 d。取幼葉，用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號(hào)DP305-3）提取基因組并保存于－20℃冰箱待用。25μL的PCR反應(yīng)體系，包括12.5mix（聚合酶、Mgcl2、4種核苷酸等），正反向引物各1μL，模板1μL，水9.5μL。反應(yīng)程序采用經(jīng)典的三步法進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，為了使結(jié)果穩(wěn)定可靠，相同隨機(jī)引物進(jìn)行2次重復(fù)擴(kuò)增，其2次擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖完全一致時(shí)作為結(jié)果。

2.2.3 純度鑒定

本研究的純度驗(yàn)證中，核酸水平上采用特異性PCR技術(shù)，蛋白水平上采用基于免疫印跡原理的試紙條法鑒定。確定秀水11的遺傳背景和轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號(hào)的外源轉(zhuǎn)入情況后，按照國(guó)標(biāo)（GB／T 3543.5—1995）進(jìn)行候選物的純度驗(yàn)證。各取100株完整的秀水11和克螟稻2號(hào)葉片，在液氮中研磨，磨好的粉末分成兩部分，一部分用天根試劑盒提基因組DNA，另一部分用于免疫印跡檢測(cè)特異性外源蛋白。

在核酸水平上，分別對(duì)提取好的基因組DNA進(jìn)行水稻內(nèi)標(biāo)基因SPS和KMD 2外源基因（序列見(jiàn)表1）PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)產(chǎn)物，分析秀水11和克螟稻2號(hào)的純度。

在蛋白水平上，根據(jù)說(shuō)明書(shū)，分別取每個(gè)植株上的0.1 g葉片，磨碎，加入2 mL蒸餾水。將混勻的浮濁液移到2 mL的離心管中，靜置，取上清。從包裝中取出檢測(cè)條，有“箭頭”和“sample”標(biāo)記端為樣品端。樣品端垂直向下，插入準(zhǔn)備好的樣品液中，樣品端浸入樣品液的深度約為0.5 cm，不超過(guò)“sample”標(biāo)記部位。浸置10 s左右，取出平放，閱讀檢測(cè)結(jié)果。

純度分析采用式（1）和式（2）

式中，P為品種純度；t為供檢種子數(shù)；t0異品種子數(shù)。

式中，p為標(biāo)準(zhǔn)值或標(biāo)簽值；q＝100－p；n為樣品的粒數(shù)或株數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 轉(zhuǎn)化事件的真實(shí)性鑒定

圖1、圖2分別為克螟稻2號(hào)和秀水11PCR產(chǎn)物的電泳圖譜。圖1表明，陽(yáng)性水稻克螟稻2號(hào)存在特異性Bt抗蟲(chóng)性外源基因，沒(méi)有被其它品種的抗蟲(chóng)性外源基因及抗除草性外源基因污染。圖2表明，外源基因在陰性秀水11上沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，沒(méi)有被相關(guān)的外源基因污染，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的要求。

3.2 候選物的指紋圖譜分析

圖1 克螟稻2號(hào)PCR產(chǎn)物的電泳圖譜

圖2 秀水11PCR產(chǎn)物的電泳圖譜

根據(jù)引物的多態(tài)性從94對(duì)隨機(jī)簡(jiǎn)并引物中篩選出14對(duì)簡(jiǎn)并引物，此多態(tài)性產(chǎn)物穩(wěn)定性好、雜帶少，且能夠較好地區(qū)分克螟稻2號(hào)及其親本秀水11與其他18種粳稻。以隨機(jī)引物RM224在20個(gè)水稻中PCR產(chǎn)物的電泳圖為例，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3表明SSR（引物RM224）具有3條多態(tài)性條帶，其分子量大小約為160 bp、140 bp和130 bp，bp（base pair）為基因（堿基對(duì)）序列長(zhǎng)。根據(jù)電泳圖譜將20種水稻分為4類：1～4、6、7為一類；5為一類；8為一類；9～20為一類。

圖3 秀水11及克螟稻2號(hào)和18種粳稻的SSR（RM224）帶型比較

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，視每條多態(tài)性條帶為1個(gè)等位基因；在相同的遷移位置，將觀察到的每片段作為一個(gè)性狀，有帶賦值“1”，無(wú)帶賦值“0”，將有多態(tài)性的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行記錄和制表。表2為由14對(duì)具有多態(tài)性引物構(gòu)建的20種水稻指紋圖譜，其品種編號(hào)1～20號(hào)與本文中第2.1節(jié)中20個(gè)水稻列出的次序?qū)?yīng)。

根據(jù)表2，從橫向看，秀水11和克螟稻2號(hào)（編號(hào)3和編號(hào)4）的指紋圖譜信息一樣，與其他18種粳稻相比，具有唯一的指紋信息，所以秀水11和其轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號(hào)具有相同的遺傳背景，是同一品種。從縱向看，20種水稻在14對(duì)引物上呈現(xiàn)出不同的多態(tài)性和類別，表2表明，SSR（RM224）呈現(xiàn)出3種多態(tài)性和4個(gè)類別，分別為100，010，001及101；SSR336呈現(xiàn)出3種多態(tài)性和3個(gè)類別，分別為100，010及001。利用這14對(duì)引物的指紋圖譜組合，能夠較好地區(qū)分秀水11和克螟稻2號(hào)與18種粳稻。14對(duì)引物的特異性組合構(gòu)成了秀水11和克螟稻2號(hào)的指紋圖譜，由表2中的編號(hào)3和編號(hào)4得知為同一條信息鏈，即0100011010010010100011000100010101001。

表2 由14對(duì)具多態(tài)性引物構(gòu)建的20種水稻的SSR指紋圖譜

3.3 候選物純度分析

對(duì)提取好的克螟稻2號(hào)和秀水11各100株基因組DNA進(jìn)行1到100的編號(hào)，10個(gè)編號(hào)為1幅電泳圖。秀水11只有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增（81 bp），為100%陰性，克螟稻2號(hào)既有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增（174 bp），又有目標(biāo)外源基因擴(kuò)增（81 bp），為100%陽(yáng)性。

利用抗體抗原免疫顯色反應(yīng)原理，將100株克螟稻2號(hào)葉片和100株秀水11葉片進(jìn)行試紙條檢測(cè)，見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 秀水11試紙條法檢測(cè)結(jié)果

圖5 克螟稻2號(hào)的試紙條法檢測(cè)結(jié)果

圖4和圖5表明，秀水11的100株均只有在對(duì)照線上有紅線，檢測(cè)線上無(wú)紅線，克螟稻2號(hào)的100株不僅在對(duì)照線上有紅線，檢測(cè)線上也有紅線，其結(jié)果與假定結(jié)果相符合。

根據(jù)純度結(jié)果和容許差距公式可知，秀水11：T≤1.6；克螟稻2號(hào)：T≤1.6。因此，秀水11和其轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號(hào)的純度符合作為種子原材料的純度要求（≥99%）［12］。

4 討 論

本文提出了轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原材料真實(shí)性鑒定的技術(shù)體系。轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)入事件的真實(shí)性鑒定需包含兩方面的內(nèi)容：一是轉(zhuǎn)基因事件的真實(shí)性，包括轉(zhuǎn)基因事件是否真實(shí)發(fā)生、外源基因是否為目標(biāo)基因、插入位置是否正確。二是受體的真實(shí)性，即轉(zhuǎn)基因作物的遺傳背景是否為目標(biāo)受體親本。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，目前還未見(jiàn)針對(duì)秀水11品種進(jìn)行品系鑒定的相關(guān)報(bào)道，將克螟稻2號(hào)和陰性受體秀水11與其他18種粳稻一起來(lái)構(gòu)建指紋圖譜，目的是為了鑒定和建立秀水11及其轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻2號(hào)的品系和圖譜。純度鑒定方面，在核酸水平鑒定的基礎(chǔ)上，還進(jìn)行蛋白水平的鑒定，可較好地解決轉(zhuǎn)基因植物中基因失活或基因沉默現(xiàn)象的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品秀水11為100%陰性材料，克螟稻2號(hào)為100%陽(yáng)性材料，符合候選物純度需在99%以上的要求。

本文鑒定了轉(zhuǎn)入事件的真實(shí)性，給出了秀水11的品系圖譜，分析了秀水11及其陽(yáng)性水稻克螟稻2號(hào)的純度，為其它轉(zhuǎn)基因作物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原材料真實(shí)性鑒定提供了參考和借鑒。

［1］ 高運(yùn)華，黎朋，劉張嵐，等.轉(zhuǎn)基因水稻標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制［J］.計(jì)量學(xué)報(bào)，2010，31（5A）：14－18.

［2］ 傅博強(qiáng)，臧超，宋貴文，等.轉(zhuǎn)基因玉米MON810基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Q-PCR量值協(xié)同實(shí)驗(yàn)室研究［J］.計(jì)量學(xué)報(bào)，2011，32（6A）：114－118.

［3］ 施勇烽，應(yīng)杰政，王磊，等.鑒定水稻品種的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，2005，19（3）：195－201.

［4］ 張彥，郭士偉，何冰，等.利用SSR標(biāo)記建立雜交水稻分子指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，22（2）：181－183.

［5］ 余笑波，葉子弘，隋志偉，等.轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的初制備［J］.計(jì)量學(xué)報(bào)，2011，32（6A）：101－105.

［6］ 謝家建，王錫鋒，彭于發(fā).轉(zhuǎn)基因水稻品系克螟稻2號(hào)1的外源插入片段的旁側(cè)序列：中國(guó)，101240278A［P］.2008-08-13.

［7］ 盧長(zhǎng)明，吳剛，武玉花，等.轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1轉(zhuǎn)化事件外源載體整合位點(diǎn)全序列及應(yīng)用：中國(guó)，101302520A［P］.2008-11-12.

［8］ 謝家建，王錫鋒，彭于發(fā).轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的外源插入片段的旁側(cè)序列：中國(guó)，101240279A［P］. 2008-08-13.

［9］ RenéK?ppel，F(xiàn)ranziska Zimmerli，Alda Breitenmoser. Multiplex real-time PCR for the simultaneous detection and quanti Wcation of DNA from three transgenic rice species and construction and a pplication of an artiW cial oligonucleotide as referencemolecule［J］.EurFoodRes Technol，2010，230：731－736.

［10］ Jiang L，Yang L，Zhang H，etal.International collaborative study of the endogenous reference gene，sucrose phosphate synthase（SPS），used for qualitative and quantitative analysis of geneticallymodified rice［J］.JAgricFoodChem，2009，57（9）：3525－3532.

［11］ GB／T 20396—2006三系雜交水稻及親本、真實(shí)性和品種純度鑒定DNA分析方法［S］.

［12］ 程保山.SSR標(biāo)記在粳稻恢復(fù)基因Rf-1轉(zhuǎn)育、F1純度和品種鑒定中的應(yīng)用［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

Research on Identification Technique for Raw Materials of Matrix Reference Materials of Transgenic Rice

YU Xiao-bo1， YING Rong1， YU Xiao-ping1， CUIHai-feng1， WANG Jing2，
SUIZhi-wei2， LILiang2， ZANG Chao2， YE Zi-hong1
（1.College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou，Zhejiang 310018，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China）

Based on PCR and agarose gel electrophoresis，the authenticity of identification of transgenic rice KMD 2 and negative receptor Xiushui 11 is researched.The detection of special transgenic gene and other foreign genes in raw materials isby typicality identification.No other foreign genes are detected except special foreign gene Cry1Ab in transgenic rice KMD 2，and no foreign genes is detected in Xiushui 11.Based on fingerprint technology，including Xiushui 11 and KMD 2 there are 20 rice varieties，and the results showed that Xiushui11 and KMD 2 have the same fingerprint and also be different from other 18 rice varieties.Random sampling for KMD 2 and Xiushui 11，and take special PCR and immunoblotting technique for the selected samples purity，KMD 2 are 100%transgenic rice and Xiushui 11 are 100% negative receptors rice.

Metrology；Transgenic rice；Matrix reference materials；Line identification；Purity identification； Fingerprint technique

TB99

A

1000-1158（2014）05-0512-05

10．3969／j．issn．1000-1158．2014．05．21

2012-04-23；

2014-06-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（31000357）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD27B01）；浙江省自然科學(xué)基金（Y3090173）；浙江省公益項(xiàng)目（2014C32022）；浙江省重點(diǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2010R50028）

余笑波（1985－），男，浙江臺(tái)州人，中國(guó)計(jì)量學(xué)院碩士，主要從事生物中核酸計(jì)量研究。yuxiaobo.123＠163.com