抑制miR-886-5p表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞侵襲的影響

王建新 馬翠花

宮頸癌為婦科常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的生命健康，受到全世界的廣泛關(guān)注［1］。雖然已知宮頸癌的發(fā)病與人乳頭瘤病毒(HPV)感染有關(guān)，但是腫瘤的形成機(jī)制仍未完全闡明。近些年一類新的非蛋白編碼microRNAs(miRNAs)的出現(xiàn)，為腫瘤研究提供了新的思路。miRNAs是一類長(zhǎng)約21～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增值，凋亡以及腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起了很重要的作用［2，3］。有研究發(fā)現(xiàn) miR-886-5p在宮頸癌的含量明顯高于癌周及癌旁組織［4］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)下調(diào)人宮頸癌SiHa細(xì)胞miR-886-5p的表達(dá)，采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究miR-886-5p在SiHa細(xì)胞中的生物學(xué)行為，為宮頸癌的診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 宮頸癌SiHa細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。帶有GFP標(biāo)簽的抑制miR-886-5p表達(dá)及對(duì)照質(zhì)粒(miR-886-5p inhibitors/NC)均來(lái)自中國(guó)吉瑪公司。主要試劑:DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司，三氯甲烷、異丙醇和無(wú)水乙醇均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，TRIzol試劑，MML-V試劑盒和 LipofectamineTM2000均為美國(guó) Invitrogen公司產(chǎn)品，質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自博大泰克公司，SYBR Premix Ex Taq試劑購(gòu)自TakaRa公司，PCR擴(kuò)增引物的合成與 DNA測(cè)序均由上海生工公司完成。Transwell?及培養(yǎng)皿均購(gòu)自Corning公司，Matrigel購(gòu)自BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 SiHa細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，每3天換液1次，0.25% 胰酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察。在轉(zhuǎn)染前1天用12孔板接種細(xì)胞，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜，待轉(zhuǎn)染帶有GFP標(biāo)簽的miR-886-5p inhibitor/NC質(zhì)粒，每組3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞長(zhǎng)滿60%培養(yǎng)孔底時(shí)，用不含血清的DMEM各500 μl分別稀釋2 μg待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和5 μl LiPofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑，室溫放置5 min后，將兩者混合作用20 min形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。分別將1 ml帶有miR-886-5p inhibitor/NC質(zhì)粒的DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入各培養(yǎng)孔，輕輕搖勻，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)過(guò)夜。

1.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，加入5 μg/ml Blasticidin進(jìn)行篩選，每5天換液1次，直到長(zhǎng)出細(xì)胞克隆，在顯微鏡下用胰酶消化，挑出克隆，移至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿繼續(xù)用Blasticidin篩選液培養(yǎng)。3～4周后，熒光倒置顯微鏡下觀察表達(dá)GFP的陽(yáng)性克隆，再次用胰酶消化，挑出陽(yáng)性克隆并用1 μg/ml Blasticidin篩選液大量培養(yǎng)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)抑制水平 按產(chǎn)品說(shuō)明書，用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)測(cè)RNA質(zhì)量。用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于－80℃待用。使用ABI 7500 PCR儀，以hs-U6作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)檢測(cè)miRNA的表達(dá)，反應(yīng)包括40個(gè)循環(huán)(95℃，30 s;60℃，1 min)，每次設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。特異性miR-886-5p的上下游引物分別為5’-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3’和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;U6 snRNA 的上下游引物分別為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’和5’-GGAACGCTTCACGA-ATTTG-3’。其擴(kuò)增曲線和融解曲線說(shuō)明引物具有很好的特異性，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析進(jìn)一步證實(shí)擴(kuò)增特異性。采用ΔΔCt法分析基因的表達(dá)水平［5］，即 RQ=2-ΔΔCt，［ΔΔCt=(CtmiRNA–CtU6)樣品-(CtmiRNA–CtU6)校正樣品］。每次實(shí)驗(yàn)包括以水為模板的陰性對(duì)照，根據(jù)(2-ΔΔCT)計(jì)算每對(duì)樣本的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Matrigel體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，用0.25%胰酶消化制備成無(wú)血清DMEM單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml。BD Matrigel TM Invasion Chamber結(jié)構(gòu)包括上室和下室兩個(gè)部分，上室已經(jīng)鋪好凝膠化的Matrigel基質(zhì)，該物質(zhì)模仿人體內(nèi)的基底膜結(jié)構(gòu)，膠的下方有一層PET膜，上面有許多直徑8 μm的微孔，細(xì)胞根據(jù)其不同的侵襲能力突破基質(zhì)膠后從小孔中穿過(guò)至PET膜的底面。上室加入100 μl無(wú)血清DMEM細(xì)胞懸液，下室加入650 μl含5%血清的DMEM培養(yǎng)基，將小室提起，去除氣泡后，置37℃、5%CO2細(xì)胞孵箱溫育12 h后，用棉簽?zāi)ㄈド鲜疑媳砻婕?xì)胞和Matrigel凝膠后，用PBS洗滌5次，用10%的甲醇固定上室下表面細(xì)胞10 min，用10 μg/ml的DAPI染色1 min后于倒置顯微鏡下，每孔隨機(jī)取3個(gè)視野計(jì)數(shù)后取平均值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，雙尾t檢驗(yàn)用于2組獨(dú)立樣本之間差異的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后miR-886-5p的表達(dá)水平 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后表達(dá)抑制組和對(duì)照組細(xì)胞中miR-886-5p的表達(dá)水平，表達(dá)抑制組明顯低于對(duì)照組(P ＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 篩選穩(wěn)定克隆后SiHa細(xì)胞中miR-886-5p的表達(dá)水平(U6snRNA為內(nèi)參，*P ＜0.05，n=3)

2.2 miR-886-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響 在顯微鏡下觀察Matrigel體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)數(shù)上室PET膜下表面穿出的細(xì)胞個(gè)數(shù)(焦距100×)，每組細(xì)胞每次隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野取平均值為穿膜細(xì)胞均數(shù)。分別為Mock組穿膜細(xì)胞均數(shù)，穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-886-5p inhibitor對(duì)照質(zhì)粒穿膜細(xì)胞均數(shù)，穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-886-5p inhibitor質(zhì)粒穿膜細(xì)胞均數(shù)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-886-5p inhibitor質(zhì)粒的SiHa細(xì)胞其體外侵襲能力比未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒組細(xì)胞均明顯減弱。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-886-5p對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響。A Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)分析SiHa細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-886-5p抑制質(zhì)粒及其陰性對(duì)照質(zhì)粒后的侵襲能力，侵襲膜下表面細(xì)胞DAPI染色后熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果(焦距100×);B鏡下侵襲膜下表面細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)用Mean±SD表示(*P ＜0.01，n=10)

3 討論

miRNA作為生物體重要的基因調(diào)控分子，在多種惡性腫瘤組織中的表達(dá)與正常組織中存在顯著差異，miRNA的紊亂表達(dá)可引起組織細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6］。宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病與高危型人乳頭瘤狀病毒(HPV)的感染密切相關(guān)，但是感染后確切的分子機(jī)制仍不清楚。近來(lái)，與宮頸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡密切相關(guān)的miRNA已逐漸引起人們的關(guān)注［7］。miRNA表達(dá)分析顯示，miR-143、miR-145顯著下調(diào)，能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，與腫瘤發(fā)生相關(guān);miR-146a顯著上調(diào)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的能力［8］。Iorio等［9］利用以 PCR 為基礎(chǔ)的已建立的miRNA檢測(cè)分析102例宮頸癌樣本，發(fā)現(xiàn)miR-200a能夠抑制宮頸癌細(xì)胞南上皮層向肌層侵襲，miR-200a過(guò)表達(dá)明顯減少了宮頸癌細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，下調(diào)miR-886-5p可顯著抑制SiHa細(xì)胞的侵襲能力。由此，我們初步推測(cè)miR-886-5p在宮頸癌中可能發(fā)揮癌基因的作用，提示靶向抑制miR-886-5p為宮頸癌的治療提供了新思路。

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