術后腸梗阻對大鼠腦內nesfatin-1表達影響

（青島大學醫(yī)學院山東青島266021；*青島市立醫(yī)院）

術后腸梗阻對大鼠腦內nesfatin-1表達影響

武慶杰，胡沙沙，逄明杰＊，祝海＊，王萍＊，郭菲菲，孫向榮，徐珞

（青島大學醫(yī)學院山東青島266021；*青島市立醫(yī)院）

目的探討術后腸梗阻對大鼠腦內nesfatin-1表達及臨床意義。方法大鼠經(jīng)腹腔注射硫酸仲丁巴比妥(100～150）mg/kg麻醉后行腹部手術，術后2小時后經(jīng)心灌注固定，免疫組化觀察大鼠腦內c-Fos和nesfatin-1免疫陽性神經(jīng)元的表達。結果手術組大鼠下丘腦室上核（SON）(P＜0.01)，室旁核（PVN）（P＜0.01)，藍斑（LC）(P＜0.05)、動眼神經(jīng)副核（EW）(P＜0.01)、中縫蒼白核（rRPa）(P＜0.05)、孤束核（NTS）(P＜0.01)、延髓腹外側區(qū)（VLM）(P＜0.01)神經(jīng)元c-Fos表達顯著增加,而nesfatin-1免疫陽性神經(jīng)元表達無顯著改變(P＞0.05)。發(fā)現(xiàn)腹部手術可激活的c-Fos神經(jīng)元中，在下丘腦SON內99%、apPVN內71%、lmPVN內47%、mmPVN內41%以及mp-PVN內9%表達nesfatin-1；在腦干、腹部手術可分別激活LC內91%、rRPa內82%、EW和VLM內74%、NTS 14%表達c-Fos的nesfatin-1神經(jīng)元。結論腹部手術可激活下丘腦和腦干攝食相關中樞內nesfatin-1神經(jīng)元，其對攝食和胃排空障礙疾病調控具有潛在臨床意義。

腹部手術；Fos；下丘腦；NUCB2；術后腸梗阻；大鼠大腦；免疫組化；Nesfatin-1

動物腹部手術可造成術后腸梗阻模型，在胃腸道手術后，表現(xiàn)為有效抑制腸內容物轉運，延遲胃排空。腹部手術中可激活實驗動物和人類應激反應時的內分泌標記物[1-3]。其前研究報道過大鼠腹部手術后可激活大鼠大腦特定核團的神經(jīng)元，包括下丘腦視上核（SON）、室旁核（PVN）及含兒茶酚胺的腦干區(qū)域如藍斑（LC）、孤束核（NTS）、延髓腹外側區(qū)（VLM）的神經(jīng)元[4-5]。

Nesfatin-1是最近在下丘腦中發(fā)現(xiàn)的來源于前體蛋白NUCB2的含82個氨基酸的多肽，側腦室注射或外周注射后可減少大鼠進食[6]。Nesfatin-1mRNA存在于大鼠多個核團[7-9]，包括下丘腦和腦干中表達豐富的自主核團[9]。最近發(fā)現(xiàn)給大鼠側腦室注射Nesfatin-1不僅可減少進食，而且會延遲胃排空[10]。在實驗動物和人類[11]腹部手術后可造成胃腸梗阻現(xiàn)象，推測術后胃腸梗阻可能激活nesfatin-1神經(jīng)元。因此，目前的研究，我們觀察大鼠腹部手術造成術后腸梗阻是否能激活大腦中nesfatin-1神經(jīng)元。

1 材料與方法

1.1 材料成年雄性SD大鼠，體重280～350 g，每籠4只，在特定溫度、濕度、24 h晝夜循環(huán)光照條件下生活，自由進食和飲水。

1.2 方法

1.2.1 腹部手術16只大鼠分裝在單獨籠內，禁食20 h，自由飲水。在禁食后第10 h，經(jīng)腹腔注射硫酸仲丁巴比妥(100～150mg/kg)麻醉大鼠，麻醉后四肢固定于手術臺上，腹部備皮后碘伏消毒鋪巾，于下腹部正中線做一個長約3 cm的切口，依次切開皮膚、腹壁肌肉后進腹。實驗組大鼠（8只）術后將盲腸取出，用鹽水濕紗布由盲腸末端自下而上擦拭腸管，反復6次左右，隨后將盲腸放回腹腔，縫合肌肉和皮膚。麻醉和手術持續(xù)大約10min，動物在2～3min后蘇醒。對照組大鼠（n=8）僅接受麻醉不進行腹部手術。

1.2.2 c-Fos和Nesfatin-1免疫組化染色大鼠經(jīng)腹腔注射硫酸仲丁巴比妥(100～150mg/kg)麻醉[35]，經(jīng)心灌注固定，亦即用0.9%氯化鈉溶液和4%多聚甲醛灌注固定。斷頭取腦，后固定12 h，10%蔗糖脫水24 h后速凍。冠狀切片，用自動漂浮技術孵育腦片。加兔抗-c-Fos血清，4℃過夜，隨后加入山羊抗兔IgG，孵育2 h。Fos顯色用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和硫酸鎳鉻。腦片繼續(xù)在兔抗鼠nesfatin-1孵育液中孵育12 h（℃），用生物素-羊抗兔IgG孵育2 h，3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。切片梯度乙醇和二甲苯脫水，封片。深藍色核染的是c-Fos細胞，棕色細胞質顯色的是Nesfatin-1免疫陽性細胞，胞質為棕色，核染色為黑色的是雙染細胞。

1.2.3 細胞計數(shù)光學顯微鏡下觀察c-Fos和nesfatin-1免疫陽性細胞。通過Paxinos和Watson’s圖譜定位，定量評估免疫反應細胞數(shù)。c-Fos和nesfatin-1免疫陽性細胞數(shù)=c-Fos或nesfatin-1平均細胞數(shù)/每個核團的細胞總數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理用GraphPad Prism 3.0軟件分析，所有數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 術后腸梗阻對腦內nesfatin-1-免疫陽性細胞表達的影響本研究定量分析結果顯示，對照組和手術組大鼠SON或PVN內nesfatin-1免疫陽性細胞數(shù)無明顯差異(P＞0.05;圖1和表1)。與對照組相比，手術處理組大鼠PVN內c-Fos免疫陽性神經(jīng)元顯著增加（表1），即：mpPVN(t=17.2;P＜0.01)、mmPVN(t= 25.8，P＜0.01)、lmPVN(t=19.5;P＜0.01)和apPVN(t= 22.1;P＜0.01)內c-Fos免疫陽性神經(jīng)元表達顯著增多。手術處理組大鼠下丘腦SON和PVN內c-Fos/ nesfatin-1雙染細胞與對照組相比也顯著增加（圖1，表1），即：SON(t=6.9,P＜0.01)、apPVN(t=58.4,P＜0.01)、lmPVN(t=18.5,P＜0.01),mmPVN(t=16.5,P＜0.01)和mpPVN(t=6.9,P＜0.01)內c-Fos/nesfatin-1雙染細胞顯著增多，腹部手術分別可激活SON內99%、apPVN內71%、lmPVN內47%、mmPVN內41%以及mpPVN內9%的表達c-Fos的nesfatin-1神經(jīng)元，與對照組相比，**P＜0.01，見圖1。

圖1 術后腸梗阻對視上核Nesfatin-1和c-Fos表達的影響

表1 腹部手術對大鼠下丘腦PVN nesfatin-1和c-Fos表達的影響（±s,number/section)

表1 腹部手術對大鼠下丘腦PVN nesfatin-1和c-Fos表達的影響（±s,number/section)

P均＜0.01

組別n apPVN mpPVN mmPVN lmPVN對照組8 38.5±12.2 48.2±15.1 99.5±32.1 160.2±52.1手術組8 41.2±13.1 48.2±15.1 98.2±31.1 149.3±45.1

表2 腹部手術對大鼠下丘腦PVN c-Fos表達的影響（±s,number/section)

表2 腹部手術對大鼠下丘腦PVN c-Fos表達的影響（±s,number/section)

P均＜0.01

組別n apPVN mpPVN mmPVN lmPVN對照組8 5.1±1.2 24.3±7.2 13.2±4.3 16.5±5.2手術組8 21.2±6.4 102.2±33.4 82.3±26.1 52.3±15.4

表3 腹部手術對大鼠下丘腦PVN c-Fos+Nesfatin-1表達的影響（±s,number/section)

表3 腹部手術對大鼠下丘腦PVN c-Fos+Nesfatin-1表達的影響（±s,number/section)

P均＜0.01

組別n apPVN mpPVN mmPVN lmPVN對照組8 2.1±0.9 3.1±1.2 2.2±0.8 2.3±0.9手術組8 17.2±5.1 23.3±6.1 30.2±9.1 18.3±5.6

注：apPVN：室旁核前側小細胞區(qū)，mpPVN：室旁核內側小細胞區(qū)，mmPVN：室旁核內側大細胞區(qū)，lmPVN：室旁核側面大細胞區(qū)。

2.2 術后腸梗阻對中腦和腦干nesfatin-1和c-Fos免疫陽性神經(jīng)元表達的影響腹部手術2 h后，上述腦核團內nesfatin-1免疫活性細胞表達無明顯改變(P＞0.05)；但腹部手術可使LC(t=2.6,P＜0.05)、rRPa(t= 2.57,P＜0.05)、EW(t=10.74,P＜0.01)、VLM(t=7.86,P＜0.01)和NTS(t=10.46,P＜0.01)內c-Fos免疫反應神經(jīng)元數(shù)量顯著增加；結果顯示，腹部手術分別可激活LC內91%、rRPa內82%、EW和VLM內74%、NTS 14%的表達c-Fos的nesfatin-1神經(jīng)元，與對照組相比，*P＜0.05;**P＜0.01。見圖2。

A（LC中nesfatin-1和c-Fos免疫陽性神經(jīng)元表達）、B（EW中nesfatin-1和c-Fos免疫陽性神經(jīng)元表達）、C（rRPa中nesfatin-1和c-Fos免疫陽性神經(jīng)元表達）、D（NTS中nesfatin-1和c-Fos免疫陽性神經(jīng)元表達）、E（VLM中nesfatin-1和c-Fos免疫陽性神經(jīng)元表達）、LC（藍斑）、EW（動眼神經(jīng)副核）、rRPa（中縫蒼白核）、NTS（孤束核）、VLM（延髓腹外側區(qū)）。

圖2 術后腸梗阻對中腦和腦干nesfatin-1和c-Fos免疫陽性神經(jīng)元表達的影響

3 討論

有文獻報道下丘腦SON和PVN均有nesfatin-1免疫陽性神經(jīng)元表達。有文獻報道，中腦和腦干內也有nesfatin-1的表達，如藍斑（LC）、動眼神經(jīng)副核（EW）、中縫蒼白核（rRPa）、孤束核（NTS）以及延髓腹外側區(qū)（VLM）均有nesfatin-1的表達[7,8,9]。本研究結果顯示，大鼠腹部手術2 h后下丘腦、中腦及腦干諸核團均有不同程度的c-Fos表達增加。腹部手術還可激活絕大多數(shù)SON（99%）、LC（91%）、rRPa（82%）、EW和VLM（74%）、apPVN（71%）內的nesfatin-1免疫陽性神經(jīng)元，NTS（14%）、mmPVN（41%）以及mpPVN（9%）內只有少量nesfatin-1神經(jīng)元被激活。結果提示，腹部手術可激活腦核團內nesfatin-1免疫陽性神經(jīng)元的表達。這與文獻[7-9]報道的結果基本一致。

結果顯示，在mpPVN中激活的c-Fos免疫陽性神經(jīng)元是apPVN中的5倍，這可能是mpPVN的面積大于apPVN所致。然而，腹部手術可激活apPVN中大部分（71%）的nesfatin-1神經(jīng)元，而mpPVN中僅激活9%的nesfatin-1神經(jīng)元。這種差異可能與mpPVN神經(jīng)元的多樣化有關，有文獻報道，mpPVN中除有促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)和nesfatin-1外，還包含應激條件下可激活的甲狀腺激素釋放激素、生長激素釋放激素[12]。功能學研究表明，在PVN，尤其是在小細胞區(qū)包含CRF神經(jīng)元的部位，對手術2 h后胃排空延遲的發(fā)生具有重要作用[2-5]。胃電刺激可改善患者腸梗阻癥狀[13]，與PVN中CRF神經(jīng)元活性減弱相關[14]。側腦室注射nesfatin-1，大鼠進食減少，該效應可能是通過CRF信號通路而實現(xiàn)的，即應用選擇性CRF2受體拮抗劑astressin2-B，可完全阻斷nesfatin-1抑制大鼠的攝食效應[15]。因此，室旁核小細胞區(qū)nesfatin-1神經(jīng)元的激活可能參與術后胃排空的延遲，該效應可能與CRF信號通路有關。

VLM可以投射到LC區(qū)域[16]，LC與PVN之間也有纖維聯(lián)系[17]。電生理學研究表明，側腦室注射CRF或LC注射CRF，LC去甲腎上腺素神經(jīng)元對疼痛刺激的反應加強。各種應激，如束縛、休克、低血壓、腹部手術均會增加LC區(qū)去甲腎上腺素表達[4,8,12,18]。結果提示，LC中nesfatin-1神經(jīng)元的激活可能與腹部手術后胃腸梗阻的發(fā)生有關。

總之，腹部手術可激活PVN大細胞區(qū)及前側小細胞區(qū)、SON、LC、rRPa、EW、VLM及NTS中大部分nesfatin-1神經(jīng)元，表明腹部手術誘導的nesfatin-1神經(jīng)元激活可能對進食和胃排空的減弱有潛在調控作用。

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The Effect of Abdom inal Su rgery-induced Postoperative Ileus on Nesfatin-1 Exp ression in the Rat Brain

W u Qingjie,Hu Shasha,Pang M ingjie,etc.
(Qingdao University MedicalCollege,Qingdao 266021,Shandong;*Qingdao MunicipalHospital,Qingdao 266011,Shandong)

Ob jectiveTo investigate the effectof abdominal surgery-induced postoperative ileus on nesfatin-1-immunoreac?tive(ir)neuronsexpression in the ratbrain and the clinical significance.M ethodsRatswere anesthesiaed w ith Sulfuric acid butabar?bitaland abdom inal surgery was performed.Two hours after abdom inal surgery,ratswere transcardially perfused and brains processed for double immunohistochemical labeling of Fos and nesfatin-1.Resu ltsAbdominal surgery,induced an obvious increase of c-Fos expression in neurons of the supraoptic nucleus(SON)(P＜0.01),paraventricular nucleus(PVN)（P＜0.01),locus coeruleus(LC)(P＜0.05),Edinger-Westphal nucleus(EW)(P＜0.01),rostral raphe pallidus(rRPa)(P＜0.05),nucleus of the solitary tract(NTS)(P＜0.01) and ventrolateralmedulla(VLM)(P＜0.01),but the expression of nesfatin-1-immunoreactive cells did notdiffer(P＞0.05).The statisti?calanalysisshowed thatamong the actived c-Fosneurons,99%in the SON,71%in the anterior parvicellular PVN,47%in the lateral magnocellular PVN,41%in themedialmagnocellular PVN and 9%in themedial parvicellular PVN could expression nesfatin-1;in the hindbrain,abdom inal surgery activated nesfatin-1 neurons91%in the LC,82%in the rRPa,74%in the EW and VLM,14%in the NTS could expression c-Fos.ConclusionAbdom inal surgery can activate the nesfatin-1-ir neurons in the hypothalam ic and hind?brain food related nucles,and suggesta possible implication in the controlof food intake and gastric emptying disorder.

Abdominalsurgery;Fos;Hypothalamus;NUCB2;Postoperative ileus;Ratbrain

R574.2；R393

A

1008-4118（2014）02-0006-04

2014-03-26

10.3969/j.issn.1008-4118.2014.02.02

武慶杰，（1983-）男，現(xiàn)在菏澤醫(yī)學?？茖W校工作。

徐珞，E-mail:xu.luo@163.com

國家自然科學基金（No.81100260，No.81270460 and No.81300281）；青島市科技局項目（13-1-4-170-jch）