MALDI-TOF-MS鑒定宋內(nèi)志賀菌的臨床應(yīng)用

鮑春梅，宋新愛，崔恩博，王歡，張鞠玲，陳素明，張成龍，賈天野，曲芬，毛遠麗

MALDI-TOF-MS鑒定宋內(nèi)志賀菌的臨床應(yīng)用

鮑春梅，宋新愛，崔恩博，王歡，張鞠玲，陳素明，張成龍，賈天野，曲芬，毛遠麗

目的建立基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS）鑒定宋內(nèi)志賀菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)對臨床分離宋內(nèi)志賀菌的快速鑒定。方法建立經(jīng)提取法處理后鑒定宋內(nèi)志賀菌的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。在分別使用直接涂抹法和提取法處理后對200株宋內(nèi)志賀菌野生株進行鑒定驗證；同時針對宋內(nèi)志賀菌的不同菌相、不同激光強度和不同樣本保存時間分別進行MALDI-TOF-MS鑒定。再選取100株大腸埃希菌，進行MALDI-TOF-MS鑒定，以確定新建數(shù)據(jù)庫的特異性。結(jié)果宋內(nèi)志賀菌經(jīng)提取法處理后的鑒定符合率為100%，經(jīng)直接涂抹法處理后的鑒定符合率為71.5%。宋內(nèi)志賀菌不同菌相和不同激光強度的鑒定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而樣本不同保存時間鑒定結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。使用新數(shù)據(jù)庫后，大腸埃希菌鑒定符合率為96.0%。結(jié)論經(jīng)提取法處理后應(yīng)用MALDI-TOF-MS鑒定宋內(nèi)志賀菌建立的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，能快速、準確鑒定宋內(nèi)志賀菌到種水平，滿足腹瀉病原菌臨床分離株的快速診斷。

志賀菌屬；提取法；微生物學(xué)；圖譜

宋內(nèi)志賀菌屬于志賀菌D群，是引起胃腸道感染的主要病原菌之一，老人、兒童和免疫功能受損的患者多發(fā)。發(fā)達國家流行的主要是宋內(nèi)志賀菌，而發(fā)展中國家雖然長期以來流行的為福氏志賀菌，但近年來宋內(nèi)志賀菌呈明顯增加的趨勢，并成為優(yōu)勢菌群[1]。目前，大多數(shù)實驗室鑒定宋內(nèi)志賀菌的方法主要通過生化代謝反應(yīng)和血清凝集試驗來完成，一般都需要16～18 h。細菌基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ ionization-time of flightmass spectrometry,MALDITOF-MS）技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離技術(shù)，主要通過分析細菌的核糖體蛋白對細菌進行鑒定，具有速度快、通量高、鑒定準、范圍廣的特點。在很多歐洲國家質(zhì)譜儀已成功運用于臨床微生物學(xué)實驗室的診斷，此外它在防恐事件、食品安全和環(huán)境監(jiān)測的應(yīng)用也很廣泛[2]。但是，大腸埃希菌和宋內(nèi)志賀菌親緣關(guān)系的相近性，使質(zhì)譜儀在鑒定志賀菌上有一定的局限性。如果能實現(xiàn)MALDITOF-MS對宋內(nèi)志賀菌的準確鑒定，傳統(tǒng)鑒定時間可以從16～18 h縮短為3～5min。現(xiàn)將我們的研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株24株建庫的宋內(nèi)志賀菌為VITEKⅡ鑒定、生化反應(yīng)和血清凝集試驗及16SrRNA確認的臨床株，200例宋內(nèi)志賀菌驗證株為臨床分離株。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑MH培養(yǎng)基購自北京天壇生物制品有限公司，宋內(nèi)志賀菌診斷血清（批號20120501）購自寧波天潤生物制品有限公司，進行質(zhì)譜分析所需試劑包括甲酸（批號100331）、乙腈（批號106245）、三氟乙酸（批號104536）和無水乙醇（批號086987），均由美國Fisher公司提供的色譜純，BTS標(biāo)準品、基質(zhì)α-氰基-4-對羥基肉桂酸（批號165252）和MSP96孔靶由德國Bruker公司提供。PCR擴增試劑盒購自大連寶生物TaKaRa公司。

1.1.3 儀器MALDI-TOF-MS儀器由德國Bruker公司提供。VITEKⅡ全自動微生物鑒定儀由法國梅里埃公司提供。

1.2 方法

1.2.1 宋內(nèi)志賀菌的建庫

1.2.1.1 分純選取24株建庫的宋內(nèi)志賀菌，在MH培養(yǎng)基上分純后待用。

1.2.1.2 基質(zhì)和BTS標(biāo)準品配制在基質(zhì)和BTS標(biāo)準品中分別加入200μl和100μl的標(biāo)準溶液，超聲震蕩混勻，于-20℃保存?zhèn)溆?。?biāo)準溶液為50%乙腈、2.5%三氟乙酸和47.5%超純水的混合溶液。

1.2.1.3 固定滅活在1.5ml的Eppendorf微型離心管中加入300μl純凈水，用無菌牙簽挑取5mg菌落樣品加入Eppendorf微型離心管中，仔細混勻后再加入900μl無水乙醇，再次混勻后高速離心2 min，棄去上清。

1.2.1.4 蛋白溶出在棄去上清的Eppendorf微型離心管中加入50μl70%甲酸，仔細混勻后再加入50μl純乙腈，再次混勻后高速離心2min，吸取上清點靶。

1.2.1.5 點靶先點1μl上清，放干后再點1μl基質(zhì)。每個相同的菌液在靶位上排列4個點，BTS標(biāo)準品1μl放在96孔靶的任一位置，放干后再點1μl基質(zhì)，待干燥后上機。

1.2.1.6 采集數(shù)據(jù)放入已點好樣品和校準品的靶板。打開FlexControl軟件，校準儀器，選擇數(shù)據(jù)采集方法，調(diào)好儀器參數(shù)，采用氮基光源、線性陽離子檢測模式，延遲時間為130 ns，激光強度為40%，每個樣本設(shè)激光隨機射擊100個點，每次射擊5次，采集范圍為2000～20 000 Da。用鼠標(biāo)點擊“開始”按鈕，采集標(biāo)準品的數(shù)據(jù)進行儀器校準。然后編輯自動采集方法“AutoXecute Method”，用鼠標(biāo)點擊“開始”按鈕，采集宋內(nèi)志賀菌的樣品數(shù)據(jù)，每個菌株采集20張譜圖并保存。

1.2.1.7 建立數(shù)據(jù)庫將采集好的24株宋內(nèi)志賀菌的480張譜圖數(shù)據(jù)打開后，點擊“createMSP”，將譜圖調(diào)入D:dateshd的根目錄下，完成數(shù)據(jù)庫的建立。

1.2.2 宋內(nèi)志賀菌經(jīng)2種不同處理方法后的質(zhì)譜儀鑒定

1.2.2.1 直接涂抹法點靶經(jīng)VITEKⅡ全自動微生物鑒定儀和血清凝集試驗確認后的200株宋內(nèi)志賀菌臨床野生株培養(yǎng)、分純后，用無菌牙簽取單個菌落直接涂抹于靶板上，放干后在每個載有標(biāo)本的靶位上點上基質(zhì)，待干燥后上機鑒定。標(biāo)準品點在靶位的任一位置。

1.2.2.2 提取法點靶取上述200株宋內(nèi)志賀菌臨床野生株參照1.2.1.3～1.2.1.4所述宋內(nèi)志賀菌建庫時的步驟處理后，每株菌先點1μl上清液于靶板上，放干后再點1μl基質(zhì)，待干燥后上機鑒定。標(biāo)準品點在靶位的任一位置。

1.2.2.3 采集數(shù)據(jù)同1.2.1.6，每個菌株累計500個點，保存譜圖。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)分析采集數(shù)據(jù)后，使用Biotyper原有數(shù)據(jù)庫以及新建宋內(nèi)志賀菌數(shù)據(jù)庫聯(lián)合進行分析鑒定。

1.2.2.5 結(jié)果判斷細菌菌屬及種判斷標(biāo)準如下：2.300～3.000分，完全可靠地鑒定到種的水平；2.000～2.299分，可靠鑒定到屬的水平，有可能鑒定到種的水平；1.700～1.999分，有可能鑒定到屬的水平；0.000～1.699分，沒有可信的鑒定結(jié)果。

1.2.3 宋內(nèi)志賀菌不同菌相的質(zhì)譜儀鑒定分別取23株宋內(nèi)志賀菌的Ⅰ相和Ⅱ相，使用提取法進行鑒定。宋內(nèi)志賀菌Ⅰ相為光滑型菌落，Ⅱ相為粗糙型菌落，Ⅰ相和Ⅱ相分別用宋內(nèi)志賀菌血清凝集試驗確認。

1.2.4 設(shè)置不同激光強度的質(zhì)譜儀鑒定設(shè)置不同儀器參數(shù)，激光強度分別設(shè)置為40%和50%，使用提取法進行宋內(nèi)志賀菌鑒定。

1.2.5 樣本不同保存時間的質(zhì)譜儀鑒定選取90株宋內(nèi)志賀菌在提取法固定滅活后，分別采用立即點靶上機和固定滅活后樣本放置4℃冰箱冷藏10 d后上機鑒定。

1.2.6 宋內(nèi)志賀菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的特異性驗證選取100株經(jīng)生化反應(yīng)和VITEKⅡ鑒定確認的大腸埃希菌，使用Biotyper原有數(shù)據(jù)庫以及新建宋內(nèi)志賀菌數(shù)據(jù)庫進行分析鑒定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 2004軟件進行統(tǒng)計分析，2組計量資料呈正態(tài)分布，且方差齊，組間比較用配對t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宋內(nèi)志賀菌經(jīng)不同處理方法后的質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果2種不同的菌株前處理方法的鑒定結(jié)果不同。采用直接涂抹法后質(zhì)譜儀準確鑒定宋內(nèi)志賀菌200株，其中143株鑒定分值全部在2.300～3.000分，完全準確地鑒定到種的水平，57株被錯誤地鑒定為大腸埃希菌，鑒定準確率為71.5%（143/200）；而采用提取法后質(zhì)譜儀準確鑒定200株，200株宋內(nèi)志賀菌鑒定分值全部在2.300～3.000分，完全可靠地鑒定到種的水平，鑒定準確率為100%（200/200）。2.2宋內(nèi)志賀菌和大腸埃希菌的質(zhì)譜峰圖比對2種菌在不同分子量的蛋白峰差異較小，通過比對分析發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌的特異峰為1個，分子量約為2837Da；宋內(nèi)志賀菌的特異峰為4個，分子量分別約為3247、4164、4873、5613Da（圖1、表1）。

圖1 大腸埃希菌和宋內(nèi)志賀菌的蛋白質(zhì)圖譜Figure 1 Protein spectrum of Escherichia coli and Shigella sonnei

表1 大腸埃希菌和宋內(nèi)志賀菌主要蛋白峰信息表Table 1 M ain protein peak information of Escherichia Coli and Shigella sonnei

2.3 宋內(nèi)志賀菌不同菌相的質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果Ⅰ相與Ⅱ相鑒定分值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.101，P= 0.283）。

2.4 不同激光強度的質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果2種激光強度鑒定分值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.341，P= 0.735）。

2.5 不同保存時間的質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果90株宋內(nèi)志賀菌在提取法固定滅活后，分別采用立即點靶上機和樣本保存10 d上機鑒定。直接點靶上機的鑒定分值為（2.65±0.05）分；樣本保存10 d后上機的鑒定分值為（2.67±0.06）分，2個保存時間點樣本鑒定分值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.029，P=0.045）。

2.6 宋內(nèi)志賀菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的特異性驗證使用Biotyper原有數(shù)據(jù)庫對100株大腸埃希菌進行分析鑒定，鑒定準確率為100%。如果使用Biotyper原有數(shù)據(jù)庫以及新建宋內(nèi)志賀菌數(shù)據(jù)庫聯(lián)合進行分析鑒定，96株被準確鑒定為大腸埃希菌，鑒定準確率為96.0%（96/100）。

3 討論

宋內(nèi)志賀菌是引起細菌性腹瀉的重要病原菌，它引起的腹瀉感染一般病情較輕，具有隱匿性，而它在各群志賀菌中抵抗力最強，可能是其感染增加的原因之一。目前，在國內(nèi)實驗室使用的經(jīng)典方法為全自動微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)或API條、克氏雙糖鐵以及診斷血清，進行宋內(nèi)志賀菌的鑒定和凝集試驗，這些方法主要依賴細菌的生化代謝反應(yīng)和血清凝集來判定結(jié)果，耗時較長。MALDI-TOFMS是一種鑒定微生物的高通量方法[3-4]，它不僅可以用于臨床微生物實驗室的常規(guī)診斷，還可應(yīng)用于環(huán)境學(xué)、分類學(xué)及食品加工的質(zhì)量控制。它擁有Biotyper廣泛數(shù)據(jù)庫的質(zhì)譜技術(shù)，鑒定范圍包括常見臨床致病細菌（需氧菌、厭氧菌、苛養(yǎng)菌等）、真菌（酵母菌、絲狀真菌等）以及一些高致病性菌（土拉熱弗朗西斯菌、布魯菌、炭疽桿菌等）以及疑難菌種（奴卡氏菌、放線菌等），目前可鑒定菌種目錄已達4638種，這對于臨床感染性疾病的治療和轉(zhuǎn)歸起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜儀在鑒定細菌屬的符合率可達到95.0%和98.8%，種的符合率也可達到92.0%和83.8%，是一種準確、高效的細菌鑒定方法，它甚至不需要單克隆菌落，可利用體液標(biāo)本（血液和尿液）培養(yǎng)直接進行細菌鑒定，大大節(jié)省了臨床報告時間[5-7]。但我們也從研究中看到了質(zhì)譜儀的一些不足，比如大多數(shù)學(xué)者提出質(zhì)譜儀對肺炎鏈球菌和志賀菌的鑒定準確率低的問題。宋內(nèi)志賀菌與大腸埃希菌種族關(guān)系相近，它在Biotyper數(shù)據(jù)庫中被認為是大腸埃希菌種系的一部分，其數(shù)據(jù)庫中并沒有宋內(nèi)志賀菌的鑒定譜圖，這無疑給使用MALDITOF-MS鑒定腹瀉病原菌造成了困難。He等[8]使用Biotyper原有數(shù)據(jù)庫未能成功鑒定宋內(nèi)志賀菌，也無法將出血性大腸埃希菌與非致瀉性大腸埃希菌正確區(qū)分，而Schaumann等[9]則通過自建庫的方式，使用“support-vector-machines”聚類方法成功鑒定宋內(nèi)志賀菌以及鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌。

我們的實驗研究建立了宋內(nèi)志賀菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)宋內(nèi)志賀菌蛋白峰與大腸埃希菌的大部分蛋白峰相似，這也是2個菌屬無法區(qū)分的主要原因。通過比對分析發(fā)現(xiàn)了大腸埃希菌和宋內(nèi)志賀菌的特異峰，這些峰值代表著不同的生物分子蛋白，包括細菌內(nèi)部和表面的蛋白，這些獨特蛋白峰可以區(qū)分細菌的屬、種和亞種。

本研究對200株宋內(nèi)志賀菌臨床野生株進行質(zhì)譜儀鑒定，宋內(nèi)志賀菌經(jīng)涂抹法驗證鑒定準確率為71.5%，而經(jīng)提取法鑒定準確率為100%。這與我們先前的50例宋內(nèi)志賀菌的小樣本量研究結(jié)果相似[10]，這一結(jié)果提示質(zhì)譜儀鑒定前樣本的處理應(yīng)標(biāo)準化。直接涂抹法雖操作簡便，可重復(fù)性好，但相對而言，其質(zhì)譜峰的質(zhì)量易受涂抹均勻性、雜質(zhì)（如脂質(zhì)和多糖）峰等背景峰干擾，造成信噪比降低，直接影響鑒定結(jié)果的準確性。提取法能有效提取細菌表面蛋白，降低背景峰干擾，信噪比良好，是值得被推薦使用的處理方法[11]。國外也有文獻報道，對于疑難菌的鑒定，提取法可以得到更高的蛋白濃度及高質(zhì)量的質(zhì)譜圖，并且不會受到另外樣本儲存的影響[12]。此外，前處理法鑒定率高也可能與建庫時所選用的前處理法的一致性有關(guān)。直接涂抹法中鑒定錯誤的菌株均被誤判為大腸埃希菌，因為志賀菌和大腸埃希菌具有相同的抗原成分，在血清凝集試驗中也會有交叉凝集的現(xiàn)象發(fā)生。

宋內(nèi)志賀菌Ⅰ相呈光滑型菌落，多自急性期感染患者標(biāo)本中分離獲得。Ⅱ相為粗糙型菌落，常從慢性患者或帶菌者標(biāo)本中檢出。宋內(nèi)志賀菌的生物學(xué)特性為較屬內(nèi)其他菌種易發(fā)生變異，最常見的變異是位相變異，即Ⅰ相轉(zhuǎn)變成Ⅱ相菌。有文獻報道，宋內(nèi)志賀菌從Ⅰ相轉(zhuǎn)變?yōu)棰蛳嗍且驗閬G失了遺傳物質(zhì)的基因片段，Ⅱ相缺乏的是分子量在120～180MDa的大質(zhì)粒。通常有毒力的宋內(nèi)志賀菌Ⅰ相包含了5600、6800、110 000～117 000和170 000～237 000的堿基對[13-14]。本實驗中宋內(nèi)志賀菌不同相位的質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與宋內(nèi)志賀菌Ⅱ相丟失的遺傳物質(zhì)不在質(zhì)譜儀分析的核糖體蛋白中有關(guān)，也提示目前尚不能用質(zhì)譜儀區(qū)分菌相。

此外，質(zhì)譜儀對細菌的鑒定還會受到很多因素的影響，比如基質(zhì)的選擇、培養(yǎng)基的選擇、樣品保存時間長短、儀器參數(shù)的設(shè)置（自動或手動模式、激光強度、分子量檢測范圍）等。本實驗中通過設(shè)置不同的激光強度對宋內(nèi)志賀菌進行鑒定，在鑒定分值上并沒有發(fā)現(xiàn)差異，說明一定范圍內(nèi)激光強度的改變對采集的譜圖的影響可忽略，40%～50%的激光范圍均適用于宋內(nèi)志賀菌的鑒定。Pasella等[15]研究顯示蛋白樣本在短期（13 d）儲存中，4℃儲存條件與-80℃、-20℃和室溫（20～25℃）相比較，降解過程更容易受到影響。本實驗對于固定滅活后的樣本的穩(wěn)定性進行研究，樣本于-20℃保存10 d后質(zhì)譜儀鑒定的分值高于直接上機鑒定的分值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明固定滅活后的宋內(nèi)志賀菌樣本在-20℃的貯存環(huán)境下的穩(wěn)定性很好，這與Bruker公司提供的操作說明一致，酒精固定滅活后的樣本在2周之內(nèi)儲存于-20℃，都可以進行質(zhì)譜儀鑒定，并不會影響鑒定結(jié)果。Martiny等[16]報道，使用Microflex LT的Biotyper數(shù)據(jù)庫不能區(qū)分志賀菌和大腸埃希菌，所有的志賀菌都被誤判為大腸埃希菌。我們建立宋內(nèi)志賀菌新數(shù)據(jù)庫后，為了防止大腸埃希菌被誤判為宋內(nèi)志賀菌，隨機選取生化反應(yīng)符合大腸埃希菌的100例臨床分離株，使用新建宋內(nèi)志賀菌數(shù)據(jù)庫以及原有的Biotyper數(shù)據(jù)庫進行鑒定，大腸埃希菌的鑒定準確率為96.0%。實驗結(jié)果顯示，質(zhì)譜儀對大腸埃希菌的鑒定準確率比單獨使用Biotyper數(shù)據(jù)庫有所下降，提示在使用質(zhì)譜儀鑒定時，對于不能確定是大腸埃希菌還是志賀菌的疑難菌株，特別是來自腹瀉患者的分離株，還可以使用血清凝集輔助診斷，以免發(fā)生誤診。

MALDI-TOF-MS有關(guān)宋內(nèi)志賀菌數(shù)據(jù)庫成功建立后，可以通過自建庫的方式不斷擴充Biotyper數(shù)據(jù)庫的菌種，提高質(zhì)譜儀的鑒定能力，擴大鑒定范圍。MALDI-TOF-MS技術(shù)不但縮短了鑒定時間，也使傳統(tǒng)的繁瑣鑒定流程得以改善，為臨床腹瀉病原菌的快速診斷提供了有力的手段，實現(xiàn)了早發(fā)現(xiàn)、早治療，能更好地服務(wù)于臨床。

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（2014-03-28收稿 2014-05-08修回）

（責(zé)任編委 張玲霞 本文編輯 王 姝）

Clinical application ofmatrix-assisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry for the identification of Shigella sonnei

BAO Chun-mei,SONG Xin-ai,CUIEn-bo,WANG Huan,ZHANG Ju-ling, CHEN Su-ming,ZHANG Cheng-long,JIA Tian-ye,QU Fen*,MAO Yuan-li*
Clinical Laboratory Center,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China
*Corresponding author.QU Fen,E-mail:qf302@163.com;MAO Yuan-li,E-mail:maoyuanlee@gmail.com

objective To construct a database of Shigella sonnei isolates identified bymatrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF-MS)in order to achieve rapid identification of clinically isolated Shigella sonnei.M ethods A mass spectrometry database of Shigella sonnei isolates identified following extraction method was constructed.A total of 200 wildtype Shigella sonnei strains were identified following direct-smearmethod and extraction method,respectively.Meanwhile,the identification by MALDI-TOF-MSwas conducted for different phases of Shigella sonnei strains,at different laser intensity of the instrument and at different sample storage time.Then,100 Escherichia Coli strains were identified to verify the specificity of the newlyconstructed database.Results Concordance rates were 100%for the identification following extraction method,and 71.5%for the identification following direct-smearmethod.The results of the identification for different phases of Shigella sonnei strains and at different laser intensity of the instrumentwere not significantly different(P＞0.05),and the results of the identification at different sample storage time were significantly different(P＜0.05).Identification concordance rate of Escherichia Coli were 96.0%based on the newly-constructed database.Conclusions Based on the database of Shigella sonnei isolates identified by MALDI-TOF-MS following extraction method,a rapid and correct identification of Shigella sonnei to the species level is obtained,and a rapid diagnosis of the clinical strains of the diarrheal pathogenic bacteria is realized.

Shigella;extraction;microbiology;pictorialworks

R378.25

A

1007-8134(2014)03-0152-05

解放軍第三○二醫(yī)院院內(nèi)課題（YNKT2012030）

100039北京，解放軍第三○二醫(yī)院臨床檢驗醫(yī)學(xué)中心（鮑春梅、宋新愛、崔恩博、王歡、張鞠玲、陳素明、張成龍、賈天野、曲芬、毛遠麗）

曲芬，E-mail:qf302@163.com；毛遠麗，E-mail:maoyuanlee@gmail.com