探討3種痰TB-DNA提取方法在肺結(jié)核診斷中的應用價值

劉振專 蔡常輝 黃 貞 陳述文

（中山市第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東 中山 528447）

探討3種痰TB-DNA提取方法在肺結(jié)核診斷中的應用價值

劉振專 蔡常輝 黃 貞 陳述文

（中山市第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東 中山 528447）

目的優(yōu)選肺結(jié)核診斷中理想的痰TB-DNA提取方法。方法選擇我院肺科門診肺結(jié)核患者185例，提取其痰液樣本，應用煮沸裂解法、酚/氯仿法、以及進口離心柱法進行分析，對比實時熒光PCR結(jié)果。結(jié)果進口離心柱法下TB-DNA陽性檢出率為81.08%（150/185），明顯高于煮沸裂解法以及酚/氯仿法，P＜0.05。結(jié)論在對疑似肺結(jié)核患者痰液標本進行檢測中，可優(yōu)先選擇進口離心柱法作為TB-DNA的有效提取方法。

肺結(jié)核；診斷；TB-DNA

臨床疑似肺結(jié)核患者實驗室診斷的關(guān)鍵在于對痰液標本中的TB復合體進行檢測與分析[1]。由于TB結(jié)核分歧桿菌具有耐酸耐酶的特點，故而對DNA提取來說有一定特殊性，不同提取機制以及提取步驟干預下，會造成PCR擴增效果出現(xiàn)差異[2,3]。為合理優(yōu)選在肺結(jié)核診斷中理想的痰TB-DNA提取方法，本文以185例肺結(jié)核患者為研究對象，分別應用煮沸裂解法、酚/氯仿法、以及進口離心柱法以上3種方法進行干預，取得了確切結(jié)論，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇我院自2013年7月至2013年12月期間，肺科門診疑似肺結(jié)核患者共計185例作為研究對象，提取其痰液樣本進行研究，對臨床資料展開回顧分析。185例患者均最終確診為肺結(jié)核。其中，男性患者為120例，女性患者為65例，患者年齡在40～70周歲范圍內(nèi)，平均年齡為（56.1±2.5）歲。

1.2 方法：在對185例患者痰液標本進行預處理后，分別使用煮沸裂解法、酚/氯仿法、以及進口離心柱法對痰液標本中DNA進行提取，具體操作方法如下。

1.2.1 煮沸裂解法：使用TB核酸擴增PCR熒光檢測試劑盒中所自帶的DNA提取液進行DNA提取工作。提取液主要成分為Tris鹽酸緩沖液以及去污液。將患者痰液標本在經(jīng)過預處理環(huán)節(jié)操作后所得到的沉淀每管加入劑量為50.0 μL的DNA提取液，充分混合均勻，在100.0 ℃溫度條件下進行持續(xù)加熱（加熱時間為10.0 min），完成加熱后將其轉(zhuǎn)至室溫狀態(tài)進行離心處理（離心條件為13000 r/min，持續(xù)5.0 min），完成離心處理后在-30.0 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酚/氯仿法：自行配置細胞裂解液（配置方法為：10.0 mmol/L劑量Tris鹽酸緩沖液、乙二胺四乙酸、生理鹽水，以及十二烷基硫酸鈉與1.0 mmol/L劑量氫氧化鈉充分混合）。將患者痰液標本在經(jīng)過預處理環(huán)節(jié)操作后所得到的沉淀每管加入劑量為300.0 μL的細胞裂解液，充分混合均勻，在100.0 ℃條件下進行加熱，持續(xù)時間為15.0 min。采取酚/氯仿法對DNA進行純化，加入等體積氯仿/異戊醇（標準比例為24/1），離心處理（離心條件為10000 r/min，持續(xù)5.0 min），取上層清液，將其轉(zhuǎn)移至等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（標準比例為25/24/1）試管中，離心處理（離心條件為10000 r/min，持續(xù)5.0 min），再次將上層清液轉(zhuǎn)移至新試管，加入等體積異丙醇，顛倒混合，離心處理（離心條件為10000 r/min，持續(xù)5.0 min）。棄置上層清野后，加入1000.0 μL劑量無水乙醇進行洗滌并離心（離心條件為10000 r/min，持續(xù)1.0 min），棄置上層清液，最后將沉淀DNA溶解于50.0 μL劑量雙蒸水中，完成處理后在-30.0 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 進口離心柱法：將患者痰液標本在經(jīng)過預處理環(huán)節(jié)操作后所得到的沉淀加入劑量為100.0 μL的試劑盒緩沖液ATL（試劑盒選擇為QIAamp DNA mini kit），充分振蕩并使其產(chǎn)生懸浮。后進行點動離心處理，加入20.0 μL計量的蛋白酶K，溫箱培育（溫度為56.0 ℃，持續(xù)30.0 min），并點動離心處理，后加入200.0 μL劑量緩沖液AL，振蕩15 s并充分混合，溫箱培育（溫度為70.0 ℃，持續(xù) 10.0 min），并點動離心處理，后加入200.0 μL劑量無水乙醇，振蕩15 s并充分混合，點動離心后將溶液轉(zhuǎn)移至離心過濾柱中進行離心處理（離心條件為8000 r/min，持續(xù)1.0 min），棄濾過夜，將離心過濾柱轉(zhuǎn)移至新收集管內(nèi)。進一步加入500.0 μL劑量緩沖液AW1，同等條件離心后將離心過濾柱再次轉(zhuǎn)移至新收集管，加入500.0 μL劑量緩沖液AW2，13000 r/min離心，持續(xù)3.0 min，棄置濾過液，再次將離心過濾柱轉(zhuǎn)移至新收集管并做1.0 min離心處理，最后將200.0 μL劑量洗脫緩沖液AE通過懸空的方式向吸附膜中間位置加入，室溫條件下靜置2.0 min，8000 r/min條件做2.0 min離心處理，最后收集離心管內(nèi)液體并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標：在FQ-PCR儀器（中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)的DA-7600）支持下，完成對樣本的TB核酸擴增PCR熒光檢測工作。根據(jù)熒光曲線形態(tài)對檢測結(jié)果進行評估，評價3種痰TB-DNA提取方法的實時熒光PCR結(jié)果并進行對比。

1.4 數(shù)據(jù)處理：使用SPSS 17.0軟件進行分析，計數(shù)資料以%表示，以χ2檢驗，當P＜0.05時為差異顯著，且具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

進口離心柱法下TB-DNA陽性檢出率為81.08%（150/185），明顯高于煮沸裂解法以及酚/氯仿法下TB-DNA陽性檢出率，數(shù)據(jù)對比存在顯著差異，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 3種痰TB-DNA提取方法檢測結(jié)果對比表

3 討 論

痰液標本在提取DNA中最主要的難點在于：標本中有大量的干擾物以及雜志，DNA抽提期間容易出現(xiàn)抑制物共純化的問題，導致下游PCR擴增受到影響。本次研究中發(fā)現(xiàn)：煮沸裂解法雖應用時間較長，操作簡單，但提取TB-DNA中純度較低，無明顯優(yōu)勢，改進后的酚/氯仿法雖然能夠?qū)μ狄褐卸喽嗵且约吧爻煞诌M行去除，但操作復雜要求較高，可行性不足，而進口離心柱法有效避免了以上問題，且PCR效果良好，質(zhì)量穩(wěn)定，擴增效果確切，能夠在實驗室診斷中加以推廣，值得重視。

綜上所述，在對疑似肺結(jié)核患者痰液標本進行檢測中，可優(yōu)先選擇進口離心柱法作為TB-DNA的有效提取方法。

[1] 李素華,陳莉,王歡,等.腦脊液中TB-DNA實時熒光定量PCR分析的臨床應用價值評價[J].西南國防醫(yī)藥,2010,20(6):641-642.

[2] 周華,楊春,杜煦,等.胸水ADA、TB-DNA聯(lián)合檢測在結(jié)核性胸膜炎中的診斷運用[J].臨床肺科雜志,2012,17(6):1066-1067.

[3] 張玉平,丁顯平,張麗媛,等.T-SPOT.TB、痰涂片和TB-DNA檢測在肺結(jié)核診斷中的比較研究[J].成都醫(yī)學院學報,2013,8(1):49-51.

Application Value of Study on Extracting Method of Three Kinds of TB-DNA in Sputumin the Diagnosis of Pulmonarytuberculosis

LIU Zhen-zhuan, CAI Chang-hui, HUANG Zhen, CHEN Shu-wen
(Department of Laboratory, the Second People's Hospital of Zhongshan City, Zhongshan 528447, China)

ObjectiveTo select ideal in tuberculosis diagnosis sputum TB-DNA extraction method.Method185 cases with pulmonary outpatient tuberculosis patients choose our hospital, extract sputum samples, the application of boiling pyrolysis method, phenol/chloroform method, column and import the centrifugal method were analyzed, and compared the real-time fl uorescent PCR results.ResultsUnder import centrifugal column method TB-DNA positive detection rate was 81.08%(150/185), signif i cantly higher than the boiling cracking method and phenol/chloroform method, P<0.05.ConclusionsIn patients with suspected pulmonary tuberculosis in sputum specimens for testing, can choose imported centrifugal column priority method as effective TBDNA extraction method.

Tuberculosis; Diagnosis; TB-DNA

R521

B

1671-8194（2014）36-0016-02