微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，EGFR蛋白，P53蛋白的表達(dá)與大腸癌的臨床病理特征關(guān)系的相關(guān)性

郝鵬巖 吳勇 劉曉梅 張鏑 李文杰

【摘要】目的：探討大腸癌中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）狀態(tài)，EGFR蛋白及P53蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性。方法：應(yīng)用免疫組化方法，檢測(cè)90例大腸癌組織中MSI蛋白（MLH1蛋白，PMS2蛋白，MSH2蛋白，MSH6蛋白）、EGFR蛋白及P53蛋白表達(dá)狀態(tài)，檢測(cè)MSI基因體系及胚系突變情況，分析不同臨床病理特征的關(guān)系。

結(jié)果：在90例大腸癌組織中，免疫組化檢測(cè)出微衛(wèi)星不穩(wěn)定共16例，占比17.8%，基因檢測(cè)出微衛(wèi)星不穩(wěn)定體系突變6例，占比6.7%，其中體系與胚系均突變1例，占比1.1%。免疫組化結(jié)果顯示：腺癌伴粘液腺癌成分共15例，微衛(wèi)星不穩(wěn)定6例，占比40%，高于腺癌占比13.3%（P=0.014）。右半結(jié)腸癌共21例，微衛(wèi)星不穩(wěn)定7例，占比33.3%，高于左半結(jié)腸癌占比13.0%（P=0.033）。

免疫組化檢測(cè)出EGFR陽(yáng)性共49例，占比54.4%。其中，年齡大于67歲者46例，EGFR陽(yáng)性30例，占比65.2%，高于年齡小于66歲者占比43.2%（P=0.036）;腫瘤最長(zhǎng)徑小于4.7cm者共42例，EGFR陽(yáng)性34例，占比81%，高于腫瘤最長(zhǎng)徑大于4.7cm者占比31%（P=0.000）.

免疫組化檢測(cè)出P53突變共59例，占比65.6%。其中，淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移者55例，P53突變41例，占比74.5%，高于淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者占比51.4%（P=0.024）。

結(jié)論：在大腸癌組織中，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與癌癥類型及部位相關(guān)，EGFR蛋白表達(dá)與患者年齡及腫瘤大小相關(guān)，P53蛋白與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。因此，MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、EGFR、P53聯(lián)合篩查可以為靶向治療提供用藥指導(dǎo)，可以提高患者的生存預(yù)期。

【關(guān)鍵詞】大腸癌;微衛(wèi)星不穩(wěn)定;MMR;EGFR;P53

研究背景：

大腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。隨著政府對(duì)大腸癌篩查的重視，腸鏡的應(yīng)用，使很多大腸癌能夠做到早發(fā)現(xiàn)，早治療。但隨著人們生活習(xí)慣的改變，發(fā)病率仍呈現(xiàn)上升化、年輕化趨勢(shì)。目前大腸癌多采取以手術(shù)為主，放、化療為輔的綜合治療手段。雖然部分患者可以通過(guò)免疫療法或靶向治療獲益，但大腸癌患者的死亡率和發(fā)病率仍然呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，5年生存率僅在50%左右，疾病防控形式仍然嚴(yán)峻。

林奇綜合征是由四種錯(cuò)配修復(fù)基因（MLH1，MSH2， MSH6， PMS2）突變引起的，會(huì)增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是結(jié)直腸癌和子宮內(nèi)膜癌。錯(cuò)配修復(fù)基因是造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定的主要因素，也就是說(shuō)是由于錯(cuò)配修復(fù)蛋白（ Mismatch repair? MMR） 的表達(dá)缺失造成的。確認(rèn)林奇綜合癥攜帶者能預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)癌癥，并且對(duì)高危親屬的進(jìn)行體檢;可以改善疾病的預(yù)后，降低醫(yī)療成本。

表皮生長(zhǎng)因子受體（ EGFR） 屬于受體酪氨酸激酶HER/erbB。EGFR參與細(xì)胞損傷修復(fù)、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、侵襲、遷移、生存、分化以及激活重要的細(xì)胞信號(hào)通路等。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)顯示，EGFR 的過(guò)表達(dá)與多種實(shí)體瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。

p53的研究較多， 是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤關(guān)系最密切最常見(jiàn)的突變基因。 p53 基因在大腸癌中突變率高達(dá)70 %。因此檢測(cè)P53基因突變，并能改善p53 基因的功能對(duì)治療結(jié)腸癌尤為重要。Rayburn 等 研究發(fā)現(xiàn)， 通過(guò)改善p53 的功能，TLR9（ tol1-1ike receptor 9） 激動(dòng)劑可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡， 增加癌細(xì)胞對(duì)放、化療的敏感性。

本研究通過(guò)免疫組化SP方法研究MMR蛋白質(zhì)的表達(dá)，EGFR蛋白及P53蛋白表達(dá)，MSI基因體系及胚系突變情況，并分析其表達(dá)情況與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系。希望可以找到該蛋白是如何影響大腸癌的發(fā)病及在不同部位大腸癌中的表達(dá)意義。

材料與方法：

研究對(duì)象：本研究得到了中美醫(yī)院道德倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。選取2018 年1月至2020 年12月在京東中美醫(yī)院手術(shù)的大腸癌患者90 例。納入標(biāo)準(zhǔn)： 病理診斷證實(shí)為原發(fā)性大腸癌，術(shù)前未接受任何放化療等治療，臨床病理資料完整，均自愿參加并簽署知情同意書。大腸癌患者中男性47 例，女性43 例，年齡中位數(shù)為66歲，平均腫瘤直徑（4.7±1.77） cm; 腫瘤部位： 左半結(jié)腸69 例，右半結(jié)腸21 例; 臨床分期： Ⅰ期18 例，Ⅱ期35 例，Ⅲ期33 例，Ⅳ期4例; 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35 例，組織學(xué)分化： 低分化15 例，中分化44 例，高分化31 例。腺癌伴粘液腺癌成分15例。所有患者的組織樣本，均經(jīng)10% 的甲醛溶液固定，制成石蠟包埋切片。

MMR基因檢測(cè)：取患者癌組織（腫瘤成分在80%以上）及癌旁5cm處正常黏膜，常規(guī)切片8μm厚10張，送往北京基石醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)內(nèi)容：NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27、Penta C、Penta D、Amelogenin 。檢測(cè)方法：多重?zé)晒釶CR—毛細(xì)管電泳。檢測(cè)設(shè)備：ABI 3730xl型遺傳分析儀。按照NCI對(duì)腫瘤MSI的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，有2個(gè)及以上改變?yōu)楦叨任⑿l(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability-high，MSI-H），1 個(gè)改變?yōu)榈投任⑿l(wèi)星不穩(wěn)定性（m i c ro s ate l l i teins tabi l i ty- l ow，MSI -L），無(wú)改變?yōu)槲⑿l(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stable，MSS）。

免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)錯(cuò)配修復(fù)蛋白（m i sma t c h r e p a i r p r o t e i n ，MMR）MLH1，PMS2，MSH2，MSH6表達(dá)。腫瘤旁正常組織為正常內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照。MMR蛋白缺失表現(xiàn)為腫瘤組織核表達(dá)陰性，而腫瘤旁正常結(jié)腸黏膜上皮及淋巴細(xì)胞核陽(yáng)性。當(dāng)任何1 個(gè)蛋白表達(dá)缺失即定義為錯(cuò)配修復(fù)蛋白功能缺陷（MMR defi c i ent，dMMR）。均陽(yáng)性則為錯(cuò)配修復(fù)蛋白功能正常（ M M R proficient，pMMR）（表1）。

免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)EGFR蛋白表達(dá)。EGFR定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。計(jì)算EGFR時(shí)均根據(jù)染色強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，判斷依據(jù)則可以將其得分作為參照。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 1 分（ ≤25%） ;2 分（ 26% ～ 50%） ; 3 分（ 51% ～ 74%） ; 4 分（ ≥75%） 。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 1 分（ 淡棕色） ; 2 分（ 棕黃色） ; 3 分（ 棕褐色） 。綜合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 0 ～ 1 分（ - ） ; 2 ～3 分（ + ） ; 4 ～ 5 分（ + + ） ; 6 ～ 7 分（ + + + ） ，其中+～ + + + 為陽(yáng)性（表2）。

免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)P53蛋白表達(dá)。p53蛋白表達(dá)于細(xì)胞核，腫瘤組織75%以上核彌漫強(qiáng)陽(yáng)性或<5%染色或全陰性，則為p53突變型，5%～75%強(qiáng)弱不等陽(yáng)性表達(dá)為p53蛋白野生型（表3）。

所有免疫組化結(jié)果均由兩名主治級(jí)別以上醫(yī)師分別進(jìn)行判讀，后采用平均數(shù)。以上所有免疫組化抗體及試劑均購(gòu)自河南賽諾特生物技術(shù)有限公司，并嚴(yán)格按照試劑盒要求步驟進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果：

在大腸癌腫瘤組織中MMR、EGFR、P53蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，dMMR16例，占比17.8%，EGFR陽(yáng)性49例，占比54.4%，P53陽(yáng)性59例，占比65.6%。

大腸癌臨床病理特征與MMR、EGFR、P53蛋白表達(dá)的關(guān)系。腺癌伴粘液腺癌成的腫瘤以及腫瘤部位與dMMR有明顯關(guān)系，年齡以及腫瘤大小與EGFR蛋白表達(dá)有明顯關(guān)系，腫瘤轉(zhuǎn)移情況與P53蛋白表達(dá)有明顯關(guān)系。具體情況見(jiàn)表1。

MMR基因檢測(cè)結(jié)果顯示，微衛(wèi)星不穩(wěn)定6例，占比6.7%。其中體系與胚系均突變者1例，占比1.1%，根據(jù)臨床病史，其父親也為大腸癌患者，可以明確診斷為林奇綜合征。

討論：

河北省廊坊市三河市、香河縣和大廠回族自治區(qū)地理位置緊鄰北京市，位于北京市東側(cè)，俗稱北三縣。由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展，近10年來(lái)，北三縣外來(lái)人口增多，導(dǎo)致本地人口占比不足十分之一。往來(lái)北京市通勤的人口大約有30萬(wàn)左右。隨著人口遷徙，生活習(xí)慣的改變，目前當(dāng)?shù)卮竽c癌的發(fā)病是否受到影響，目前尚未有人研究。

有的研究表明，在大腸癌的標(biāo)本中，EGFR的表達(dá)占比達(dá)61%，本研究EGFR的表達(dá)占比54.4%，無(wú)明顯差異。EGFR的過(guò)表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，本研究顯示在部分大腸癌患者中，隨著年齡的增長(zhǎng)，EGFR的過(guò)表達(dá)率升高，說(shuō)明年齡是腫瘤轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)因素。腫瘤直徑越小，EGFR的過(guò)表達(dá)率越高，說(shuō)明腫瘤在發(fā)生的早期階段，轉(zhuǎn)移性和侵襲性會(huì)增高。

有研究表明，在大腸癌的標(biāo)本中，dMMR占比約為16%。本研究顯示dMMR占比17.8%，無(wú)明顯差異。在腺癌伴粘液腺癌的大腸癌標(biāo)本及右半結(jié)腸癌中，dMMR的表達(dá)率明顯增高。免疫組化表達(dá)出的dMMR，比基因檢測(cè)出的dMMR比例高，說(shuō)明有些基因未出現(xiàn)突變，但蛋白質(zhì)表達(dá)被沉默了。其對(duì)大腸癌的發(fā)病影響是否一致，對(duì)靶向治療是否有影響，有待進(jìn)一步研究。

本研究顯示P53的突變率為65.6%，接近70%，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的突變率增高，說(shuō)明P53不僅在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用，有可能在癌癥的轉(zhuǎn)移中也起到某些作用，有待進(jìn)一步研究。

總之，MLH1，PMS2，MSH2，MSH6，EGFR 及P53蛋白的表達(dá)與大腸癌的轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)、侵襲都有著較大關(guān)聯(lián)，因此，微衛(wèi)星不穩(wěn)定四項(xiàng)蛋白質(zhì)，EGFR及P53三者的聯(lián)合篩查可以為靶向治療提供用藥指導(dǎo)，有利于高?；颊叩脑缙谂袛啵欣诨颊哳A(yù)后的判斷。

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