小麥淀粉合成酶基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用

譚彩霞,封超年,郭文善,朱新開,李春燕,彭永欣

(1.金陵科技學(xué)院,江蘇 南京 210038;2.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009)

小麥淀粉合成酶基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法的建立及其應(yīng)用

譚彩霞1,封超年2,郭文善2,朱新開2,李春燕2,彭永欣2

(1.金陵科技學(xué)院,江蘇 南京 210038;2.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009)

利用熒光定量PCR技術(shù),對小麥淀粉合成酶基因(AGPase 1、GBSSI、SSSIII、SBEI)進(jìn)行了定量檢測,分別建立了這4種淀粉合成酶基因和內(nèi)參基因18s的Ct值與模板量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程。運(yùn)用所建立的方法對小麥籽粒4種淀粉合成酶基因在灌漿期間的表達(dá)變化情況進(jìn)行了定量分析。

小麥;淀粉合成酶基因;熒光定量PCR

小麥籽粒中淀粉約占粒重的65%～80%,其含量多少直接關(guān)系到粒重與產(chǎn)量的高低[1]。籽粒中淀粉主要是由一系列淀粉合成酶催化而成的,這些酶主要包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase polypetide,AGPase)、可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase,SSS)、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(granule-bound starch synthase,GBSS)、淀粉分支酶(starch branchingenzyme,SBE)[2]。淀粉合成酶又是由相應(yīng)的編碼基因先轉(zhuǎn)錄成m RNA,然后再經(jīng)過翻譯而成的。與淀粉合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因主要有4種,即腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(AGPase)、束縛態(tài)淀粉合成酶基因(GBSSI)、可溶性淀粉合成酶基因(SSS)、淀粉分支酶基因(SBE)。每一種酶基因含有多種同工酶基因,如AGPase基因含有大、小亞基2種基因;GBSS基因在不同組織中含有GBSSI和GBSSII兩種基因;SSS的同工酶基因則可分為三大類:SSSI、SSSII和SSSIII;SBE基因主要分為兩大類:SBE(A)和SBE(B)。這些同工酶基因在小麥中已基本被定位和克隆出來[3],為研究淀粉合成酶基因在小麥整個灌漿期間的表達(dá)變化規(guī)律、不同小麥品種之間淀粉合成酶基因表達(dá)差異以及不同栽培措施對小麥淀粉合成酶基因表達(dá)的影響創(chuàng)造了有利的條件。本試驗以AGPase 1、GBSSI、SSSIII以及SBEI這4種淀粉合成酶基因為研究對象,建立了實時熒光定量PCR檢測方法,并以此方法檢測淀粉合成酶基因在小麥籽粒灌漿過程中的表達(dá)變化規(guī)律,旨在為淀粉合成酶基因定量檢測提供一種快速、準(zhǔn)確的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為淮麥18,氮肥運(yùn)籌比例設(shè)基肥∶壯蘗肥∶拔節(jié)肥為5∶1∶4。基肥于播種前施用,壯蘗肥于越冬期施用,拔節(jié)肥于葉齡余數(shù)1.5時施用,磷(P2O5)、鉀(K2O)肥施用量90 kg·hm-2,磷、鉀肥運(yùn)籌為基肥和拔節(jié)肥各占50%。人工條播,行距為30 cm,小區(qū)面積為3 m×4 m=12 m2,重復(fù)3次,隨機(jī)區(qū)組排列。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol Reagent、DNase I購自Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑購自Ta KaRa公司,引物由上海生工技術(shù)公司合成,其它化學(xué)試劑為分析純。主要儀器為Rotor-Genem7000熒光定量PCR儀,Eppendorf超低溫離心機(jī),以及紫外/可見分光光度計等。

1.3 引物的設(shè)計與合成

利用premier 5.0引物設(shè)計軟件,根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布的AGPase1、GBSSI、SSSIII、SBEI m RNA基因序列,設(shè)計特異性引物(其引物序列見表1)。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 籽粒胚乳總RNA的提取

小麥開花期用記號筆標(biāo)記同一天開花的麥穗中上部穎花,花后每5 d每個小區(qū)取10個麥穗,剝?nèi)∽蚜?在液氮中速凍30 min后,迅速轉(zhuǎn)移到-70℃超低溫冰箱中。采用冷酚法提取小麥籽粒胚乳總RNA[4]。采用DNA酶去除RNA中的DNA分子,以防止DNA污染。

1.5 籽粒胚乳總RNA的定量

測定260、280 nm處的吸光值,計算A260/A280的值,估算總RNA的純度,通過A260的值分別對不同生育期的總RNA進(jìn)行定量。

1.6 cDNA的合成

取各樣本RNA 2μg按PrimeScript TMRT Reagent Kit試劑盒(TaKaRa公司日本)操作方法:在一個經(jīng)DEPC處理過的離心管中加入總RNA 2μL,Mix×I 1μL,oligd T 1μL,Ramdom 6 mers 1μL,加DEPC處理的滅菌水至20μL?；旌虾?7℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)20 min,85℃10 seconds對消除轉(zhuǎn)錄酶的活性,反轉(zhuǎn)錄后的cDNA貯存于-70℃冰箱。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定與結(jié)果計算

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 在樣品擴(kuò)增的同時,以試驗中不同處理的cDNA模板混合樣進(jìn)行系列稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在本試驗中把不同生育時期的cDNA模板混合按10的倍數(shù)進(jìn)行稀釋。以AGPase1、GBSSI、SSSIII、SBEI的特異引物和18 s的內(nèi)參引物進(jìn)行擴(kuò)增來獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線,縱坐標(biāo)為臨界循環(huán)值Ct,橫坐標(biāo)為稀釋濃度的對數(shù)值(Log值)。

1.7.2 定量分析 在Microsoft Excel軟件上對PCR中給出的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計分析。以18s為對照基因,校正PCR模板的拷貝數(shù)。相對量采用方法計算,即ΔCt目標(biāo)基因=Ct(目標(biāo)基因)-Ct(同一樣本18s);而相對倍數(shù)(relative quantification(目標(biāo)基因)。

表1 用于分析目標(biāo)基因表達(dá)的引物序列Table 1 Primer sequence of the target genes for analyzing expression levels

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA純度和完整性分析

所提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測,A260/280比值均在1.9～2.1之間,經(jīng)1%甲醛變性凝膠檢測鑒定,28s r RNA和18s r RNA條帶清晰可見,無明顯降解(圖1)。

2.2 淀粉合成酶基因和對照基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

淀粉合成酶基因表達(dá)量是相對于18s參照物的量而言的。經(jīng)過稀釋的濃度系列的cDNA標(biāo)準(zhǔn)模板與閾值(Ct值)的關(guān)系曲線見圖2。AGPase 1、GBSSI、SSSIII、SBEI和18s標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為-3.156、-3.667、-3.595、-3.745、-3.305,線性相關(guān)系數(shù)分別為0.998 9、0.998 4、0.999 1、0.999 9、0.999 5,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.98,說明擴(kuò)增效率較好,可用于準(zhǔn)確定量。

2.3 檢測基因表達(dá)的特異性

由圖3可知,在熒光強(qiáng)度發(fā)生變化的拐點處(熔點,Tm=85℃)可以清楚地看到一個單一的峰,其余的地方?jīng)]有雜峰。表明擴(kuò)增的產(chǎn)物為目的產(chǎn)物且特異性非常好,試驗中未出現(xiàn)引物二聚體和污染現(xiàn)象。

2.4 檢測基因表達(dá)的重復(fù)性

本試驗每個濃度的試驗樣本采用4個重復(fù),重復(fù)樣本間Ct值的差異在0.13～0.20范圍內(nèi)。圖4表明,曲線的重復(fù)效果、穩(wěn)定性很好。在擴(kuò)增前期,特別是在threshold(熒光臨界值)附近,相同樣品的曲線基本上是重疊的。擴(kuò)增后期曲線略有分散,但符合S型,不影響定量。

2.5 小麥灌漿期間籽粒淀粉合成酶基因表達(dá)變化動態(tài)

由圖5可知,4種淀粉合成酶基因表達(dá)在小麥整個灌漿期間呈單峰曲線變化趨勢,花后5 d左右開始表達(dá),5～15 d相對表達(dá)量呈線性上升趨勢,至花后15 d達(dá)最大值,之后急劇下降,30 d達(dá)最低值。

圖1 總RNA完整性檢測Fig.1 Testing of the total RNA integrity

3 結(jié)論與討論

圖2 4種淀粉合成酶基因及18s的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curves of the four starch synthase genes and 18s

圖3 4種淀粉合成酶基因及18s的溶解曲線Fig.3 The melt curves and Amp/Cycele curves of the four starch synthase genes and 18s

圖4 4種淀粉合成酶基因及18s的熒光曲線Fig.4 The cycele curves of the four starch synthase genes and 18s

圖5 淮麥18淀粉合成酶基因在灌漿期間的表達(dá)情況Fig.5 The expression of starch synthase gene after anthesis in wheat Huaimai 18

在植物基因表達(dá)分析中,常常用到的是RT-PCR、Northern blot、基因芯片等半定量技術(shù),基因表達(dá)量較低時往往難以得到理想的結(jié)果,而實時熒光定量PCR能檢測到每一輪的熒光信號的強(qiáng)度并且自動記錄到電腦軟件中[5]。實時熒光定量PCR技術(shù)從原理上主要分為兩類:一是熒光染料嵌合法;二是熒光探針法。探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加,其特異性強(qiáng),但其定量時容易受酶活性的影響、探針成本較高等使其無法普及應(yīng)用;目前比較常用的有染料類如SYBR GreenⅠ則是利用與雙鏈DNA小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加[5]。其簡單易行,成本較低,只需合成序列特異引物,可用于不同的模板,但是對擴(kuò)增的特異性要求高,可通過摸索優(yōu)化反應(yīng)條件,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,用融解曲線和凝膠電泳證實等可以解決此方法的不足[6]。本試驗中用到的就是SYBR Green熒光嵌合法。

在熒光定量PCR技術(shù)中,有一個很重要的概念—Ct值。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含義是:每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。通常采用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品所產(chǎn)生的Ct值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,最后將樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出待測樣品的濃度[7]。本試驗中4種淀粉合成酶基因和18s的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率較大且相關(guān)系數(shù)均在0.99以上,是比較理想的標(biāo)線,可用于對起始模板量的計算。

對于模板量的定量方法分2種:即絕對定量和相對定量。絕對定量指用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本量,但其標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定保存很難獲得成功[8]。而相對定量是分別測定目的基因和參比基因的量,再求出參比基因和目的基因相對量。本試驗中所使用的方法就是相對定量PCR,用來檢測m RNA表達(dá)量簡單方便[5]。

SYBR GreenⅠ染料是一種DNA結(jié)合染料,它的最大優(yōu)點就是能與所有的雙鏈DNA結(jié)合,所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,那它就會影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性[9]。本試驗從循環(huán)條件,引物濃度和退火溫度3個方面對實時熒光定量PCR條件進(jìn)行了優(yōu)化,成功地建立起檢測淀粉合成酶基因的實時熒光定量PCR方法,從小麥籽粒中擴(kuò)增到4種淀粉合成酶基因和18s基因擴(kuò)增曲線Ct值有很好的線性關(guān)系,呈明顯的S型,而且在平臺期幾乎重合,說明獲得的擴(kuò)增曲線合理;溶解曲線分析顯示出,PCR產(chǎn)物在拐點處(熔點,Tm=85℃)有單一的特異峰,峰的形狀也較銳利,沒有引物二聚體及非特異擴(kuò)增產(chǎn)物,說明設(shè)計的引物有良好的特異性。評價標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣有兩個指標(biāo):即相關(guān)系數(shù)和斜率,相關(guān)系數(shù)反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性,理想值應(yīng)大于0.98,越接近1,說明直線性越好,定量越準(zhǔn)確[10],本試驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均在0.99～1之間,表明試驗的結(jié)果可信度高,誤差小。

利用建立的SYBR Green實時熒光檢測方法定量檢測4種淀粉合成酶基因在小麥籽粒灌漿期間的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)4種淀粉合成酶基因表達(dá)均呈單峰曲線變化趨勢,花后5 d左右開始表達(dá),15 d達(dá)到最大值,之后急劇下降,此結(jié)論與前人研究結(jié)果(如Anderson等[11]認(rèn)為AGPase基因mRNA量在開花后15 d達(dá)到最高水平,此后表達(dá)迅速下降;KENT F等[12]研究表明,GBSS和SSS基因在花后5 d開始表達(dá),15 d達(dá)到最大值,之后表達(dá)驟降。)基本一致。

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(責(zé)任編輯:譚彩霞)

The Establishment and Application of a Real-time Quantitative PCR Assay for Detection of Wheat Starch Dynthase Genes

TAN Cai-xia1,FENG Chao-nian2,GUO Wen-shan2,ZHU Xin-kai2,LI Chun-yan2,PENG Yong-xin2
(1.Jinling Institute of Technology,Nanjing 210038,china;2.Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

Starch synthase genes(AGPase 1、GBSSI、SSSIII、SBEI)in wheat grains is quantitatively detected by rea1-time fluorescent quantitative PCR.The four starch synthase genes and endogenous gene(18s)are amplified respectively.The standard curve of Ct value amplified by the AGPase 1、GBSSI、SSSIII、SBEI genes or 18s gene vs amounts of the DNA template is generated and a linear regression equation is obtained consequently.The expressions of AGPase 1、GBSSI、SSSIII、SBEI during the wheat grouting are quantitively analyzed by the established method.

wheat;starch synthase genes;real-time quantitative PCR

S512.1

A

1672-755X(2014)03-0048-05

2014-05-11

國家自然科學(xué)基金資助項目(31071340);江蘇省“六大人才高峰”項目(07-G-008);江蘇高校省級重點實驗室開放課題(K10006)

譚彩霞(1977-),女,江蘇泰興人,副教授,博士,主要從事作物栽培與生理學(xué)研究。